यह पांडुलिपि सूक्ष्म जीवाणु खेती मीडिया की दर्जी डिजाइन के लिए एक सामांय दृष्टिकोण का वर्णन । यह एक चलने Kriging आधारित प्रयोगात्मक डिजाइन और पर्याप्त खेती के प्रवाह के लिए microbioreactor प्रौद्योगिकी के संयोजन कार्यप्रवाह द्वारा सक्षम है, जो प्रयोगशाला रोबोटिक्स द्वारा समर्थित है विश्वसनीयता और तरल हैंडलिंग मीडिया में गति बढ़ाने के लिए तैयारी.
औद्योगिक जैव प्रौद्योगिकी में एक मुख्य व्यापार माइक्रोबियल उत्पादन सेल कारखानों का उपयोग कर तनाव इंजीनियरिंग और जैविक प्रक्रिया की स्थिति के अनुकूलन के चलने प्रक्रिया है । एक महत्वपूर्ण पहलू खेती के सुधार माध्यम हित के उत्पाद के माइक्रोबियल गठन के लिए एक इष्टतम वातावरण प्रदान करने के लिए है । यह अच्छी तरह से स्वीकार किया है कि मीडिया संरचना नाटकीय रूप से समग्र प्रक्रिया के प्रदर्शन को प्रभावित कर सकते हैं । पोषण मध्यम अनुकूलन माइक्रोबियल प्रणालियों के साथ संयोजक प्रोटीन उत्पादन में सुधार करने के लिए जाना जाता है और इस प्रकार, इस प्रक्रिया के विकास में एक पुरस्कृत कदम है । हालांकि, बहुत बार मानक मीडिया व्यंजनों साहित्य से लिया जाता है, के बाद दर्जी खेती के माध्यम से बनाया डिजाइन एक थकाऊ काम है कि मांग microbioreactor प्रौद्योगिकी के लिए पर्याप्त खेती का प्रवाह, तेजी से उत्पाद विश्लेषिकी, साथ ही समर्थन प्रयोगशाला रोबोटिक्स द्वारा तरल हैंडलिंग चरणों में विश्वसनीयता सक्षम करने के लिए । इसके अलावा, उन्नत गणितीय तरीकों को तर्कसंगत रूप से माप डेटा का विश्लेषण करने और इष्टतम जानकारी सामग्री प्राप्त करने के लिए कुशलता से समानांतर प्रयोगों को डिज़ाइन करने के लिए आवश्यक हैं.
प्रस्तुत प्रोटोकॉल की जेनेरिक प्रकृति विभिंन प्रयोगशाला उपकरण, अंय अभिव्यक्ति मेजबान के लिए आसान अनुकूलन के लिए अनुमति देता है, और ब्याज की लक्ष्य प्रोटीन, साथ ही साथ आगे की प्रक्रिया के मानकों । इसके अलावा, अंय प्रोटीन उत्पादन दर, विशिष्ट उपज, या उत्पाद की गुणवत्ता की तरह अनुकूलन उद्देश्यों के लिए अंय अनुकूलन अध्ययन के दायरे में फिट चुना जा सकता है । एप्लाइड Kriging Toolbox (KriKit) प्रयोगों के डिजाइन के लिए एक सामान्य उपकरण (डो) कि बेहतर समग्र प्रक्रिया अनुकूलन के लिए योगदान देता है. यह भी बहु उद्देश्य अनुकूलन जो दोनों नदी के नीचे और बहाव प्रक्रियाओं के अनुकूलन में महत्वपूर्ण हो सकता है का समर्थन करता है ।
आधुनिक संयोजक जीन प्रौद्योगिकी दवा उद्योग में विभिंन अनुप्रयोगों के लिए तकनीकी एंजाइमों के व्यापक उपयोग में सक्षम बनाता है, पशु खिला, कार्बनिक रसायन, और खाद्य प्रसंस्करण1,2,3। भारी मात्रा में तकनीकी एंजाइमों का उत्पादन औद्योगिक जैव प्रौद्योगिकी के लिए एक प्रमुख विषय है और अनुकूलित संयोजक प्रोटीन उत्पादन के लिए, और दोनों तनाव और जैव प्रक्रिया इंजीनियरिंग की जरूरत है । कुशलता से इंजीनियर उत्पादन उपभेदों की पीढ़ी के लिए, विभिंन आनुवंशिक पुस्तकालयों उपलब्ध हैं, जैसे, संतुलित जीन अभिव्यक्ति4 या वृद्धि हुई स्राव दक्षता5के लिए ।
Corynebacterium glutamicum औद्योगिक पैमाने6,7 में अमीनो एसिड की एक प्रमुख निर्माता है और संयोजक प्रोटीन8 के स्रावी उत्पादन के लिए एक आकर्षक गैर पारंपरिक अभिव्यक्ति मेजबान का प्रतिनिधित्व करता है ,9. दोनों जनरल स्रावी (एसईसी) और जुड़वां arginine translocation (जैसे) मार्ग सी. glutamicum में मौजूद है और सफलतापूर्वक संयोजक प्रोटीन स्राव10के लिए आवेदन किया गया । औद्योगिक पैमाने पर एमिनो एसिड उत्पादन के बारे में प्रक्रिया इंजीनियरिंग में व्यापक अनुभव है, के रूप में अच्छी तरह से करने के लिए प्रोटीन के लिए जी/L मात्रा में स्रावित करने की क्षमता11 और बड़े पैमाने पर पाए जाने वाले प्रक्रिया सजातीयताओं के विषय में महान मजबूती खेती12,13, बना सी glutamicum औद्योगिक पैमाने पर heterologous प्रोटीन के स्रावी उत्पादन के लिए एक होनहार मंच जीव ।
पोषण मध्यम अनुकूलन माइक्रोबियल प्रणालियों के साथ संयोजक प्रोटीन उत्पादन में सुधार करने के लिए जाना जाता है14,15,16,17 और फलस्वरूप, मध्यम का समायोजन संरचना इष्टतम उत्पादकता18,19,20,21के संबंध में एक पुरस्कृत कदम है । माइक्रोबियल खेती के लिए microtiter प्लेटों (MTPs) के आवेदन पर गहन अनुसंधान22,23,24 सूक्ष्म जीवाणु खेती के लिए MTPs के विकास और डिजाइन के लिए रास्ता प्रशस्त25 ,26 और ऑनलाइन निगरानी और पर्यावरण नियंत्रण के साथ एमटीपी आधारित microbioreactor (MBR) प्रणालियों का विकास27,28। MBRs प्रयोगात्मक खेती के प्रवाह में एक महत्वपूर्ण वृद्धि सक्षम करें । इसके अलावा, MBR सिस्टम के अन्य प्रकारों से उपजी है, उदा, बुलबुला कॉलम या उभारा टैंक रिएक्टरों, माइक्रोबियल जैविक प्रक्रिया अनुकूलन के लिए उपलब्ध हैं29,30,31, ३२.
सामान्य तौर पर, ऑप्टिमाइज़ेशन अध्ययन वृद्धि प्रयोगात्मक प्रवाह से लाभ, जो भी डो के तरीके के साथ संयोजन में और अधिक शक्तिशाली हो जाता है, जैसे डिजाइन चर के बीच बातचीत का आकलन करने के लिए या उच्च आयामी खोज रिक्त स्थान को कम. नतीजतन, MBR सिस्टम का संयुक्त उपयोग, प्रयोगशाला स्वचालन, और डो जैव प्रौद्योगिकी8,16,३३,३४,३५में एक शक्तिशाली विधि साबित हुआ है ।
मीडिया अनुकूलन के लिए एक प्रोटोकॉल के संयोजन के राज्य के अत्याधुनिक प्रयोगशाला स्वचालन प्रस्तुत किया है, ऑनलाइन प्रक्रिया की निगरानी के साथ MBR प्रौद्योगिकी, और Kriging आधारित डेटा विश्लेषण/ Kriging पद्धति एक MATLAB Toolbox में लागू किया गया है (“KriKit”) जो डाउनलोड और नि: शुल्क३६का उपयोग किया जा सकता है । अनुप्रयोग उदाहरण के रूप में, स्रावी ग्रीन fluorescent प्रोटीन (GFP) उत्पादन के साथ ग. glutamicum का अधिकतम CgXII ंयूनतम माध्यम की संरचना के अनुकूलन द्वारा दिखाया गया है । GFP titer अनुकूलन उद्देश्य के रूप में चुना गया था के रूप में इसे आसानी से मात्रा जा सकता है और यह व्यापक रूप से MBR सिस्टम पर अध्ययन के लिए मॉडल प्रोटीन के रूप में लागू किया जाता है३७,३८,३९।
प्रस्तुत ढांचा चार चरणों में विभाजित है, जो चित्रा 1में सचित्र हैं । चरण बॉक्स फ़्रेम द्वारा इंगित किए जाते है और प्रोटोकॉल के अनुभागों के संगत होते हैं । पहला चरण (चित्र 1a) प्रोजेक्ट लक्ष्यों को परिभाषित करने और आवश्यक विधियों को निर्धारित करने के लिए है । डो के तरीके, MBR प्रौद्योगिकी, और प्रयोगशाला स्वचालन के संयोजन एक वृद्धि की प्रयोगात्मक प्रवाह है कि मांग शक्तिशाली डेटा प्रोसेसिंग की अनुमति देता है । दूसरा कदम (आंकड़ा 1b) के लिए संवेदनशील डिजाइन चर का पता लगाने (यानी, मध्यम घटक) अनुकूलन उद्देश्य पर उच्च प्रभाव के साथ करना है । यह ब्याज की डिजाइन चर की एक कम संख्या की ओर जाता है । तीसरा कदम (चित्रा 1C) शेष डिजाइन चर और ब्याज के उद्देश्य के बीच कार्यात्मक संबंध की एक अधिक विस्तृत जांच के लिए एक चलने अनुकूलन शामिल हैं । क्रमिक विस्तारित डेटा सेट का उपयोग करना, Kriging दृष्टिकोण unमापना स्थानों पर प्रयोगात्मक परिणाम की भविष्यवाणी के लिए लागू किया जाता है । चलने चक्र के रूप में जल्द ही बंद हो जाता है के रूप में Kriging मॉडल पर्याप्त सटीकता के साथ एक इष्टतम या पठार भविष्यवाणी । परिणाम चौथे चरण (चित्र 1 d) में सत्यापित कर रहे हैं, की पहचान इष्टतम चारों ओर एक और संवेदनशीलता विश्लेषण के साथ शुरुआत । यदि शुरू में, असंवेदनशील घटकों को भी इष्टतम क्षेत्र में असंवेदनशील पाए जाते हैं, यह मान लेना उचित है कि यह तीसरे चरण में चलने अनुकूलन प्रक्रिया के दौरान सच रखती है । बाद में, यह एक गतिविधि परख या एसडीएस-पृष्ठ की तरह, ओर्थोगोनल तरीकों के आवेदन के द्वारा अनुकूलन परिणामों की पुष्टि करने की सलाह दी है ।
प्रस्तुत प्रोटोकॉल की जेनेरिक प्रकृति अलग प्रयोगशाला उपकरण, अन्य अभिव्यक्ति मेजबान के लिए आसान अनुकूलन के लिए अनुमति देता है, और पसंद का लक्ष्य प्रोटीन, और साथ ही पीएच मूल्य या खेती के तापमान की तरह आगे की प्रक्रिया चर ।इसके अलावा, अंय प्रोटीन उत्पादन दर, विशिष्ट उपज, या उत्पाद की गुणवत्ता की तरह अनुकूलन उद्देश्यों के लिए अंय अनुकूलन अध्ययन के दायरे में फिट चुना जा सकता है ।
चित्र 1 : अनुकूलन अध्ययन के कार्यप्रवाह । चार फ्रेम बक्से प्रोटोकॉल के वर्गों के अनुरूप है, “अध्ययन और तरीकों की परिभाषा की कल्पना” (खंड 1), “संवेदनशीलता विश्लेषण” (खंड 2), “चलने अनुकूलन” (धारा 3), और “मांयता” (खंड 4) । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।
प्रस्तुत प्रोटोकॉल की जेनेरिक प्रकृति विभिंन रूपांतरों की अनुमति देता है, जैसे, अंय माइक्रोबियल अभिव्यक्ति मेजबान9,४७,४८,४९,५०, का अध्ययन करने के लिए ५१, या लक्ष्य प्रोटीन, ग्लाइकोसिलेशन पैटर्न या disulphide बांड की तरह के अंय गुणों का अनुकूलन करने के लिए । प्रोटोकॉल भी उपलब्ध प्रयोगशाला उपकरण के लिए अनुकूलित करने की आवश्यकता हो सकती है । एक MBR प्रणाली के एकीकरण प्रयोगात्मक प्रवाह को बढ़ाने की अनुमति देता है, जो समय में महान बचत में सक्षम बनाता है. हालांकि, MBR सिस्टम द्वारा पूरी तरह से लिखती और नियंत्रणीय प्रतिलेखनों की जगह जब, परिणाम की दरिद्रता8,३७,५२,५३माना जाना चाहिए । डो के तरीके और गणितीय मॉडलिंग का उपयोग कुशल प्रयोगात्मक योजना और मॉडल आधारित डेटा व्याख्या15द्वारा अध्ययन उद्देश्य५४ के संबंध में माप डेटा की सूचना सामग्री को अधिकतम करने में मदद करता है.
विधि में संशोधन
बहु उद्देश्य और विस्तार योग्य रोबोट इस अध्ययन में इस्तेमाल एक तरह से निपटने प्रणालियों के बगल में, यह उल्लेख किया जाना चाहिए कि वहां कई छोटे तरल हैंडलिंग सिस्टम व्यावसायिक रूप से उपलब्ध है जो इस कार्य को करने में सक्षम है और अंदर रखा जा सकता है च्या लामिना प्रवाह काम सत्तापक्ष करत आहे. यदि कोई स्वचालित pipetting प्रणाली उपलब्ध है, विभिंन मीडिया रचनाएं डो योजना के अनुसार भी मैनुअल pipetting द्वारा महसूस किया जा सकता है एकल और/ चूंकि मैनुअल तैयारी अधिक त्रुटि प्रवण है और काफी लंबे समय के लिए अत्यधिक ध्यान केंद्रित काम की आवश्यकता होगी, यह अलग मीडिया रचनाओं की एक कम संख्या तैयार करने की सिफारिश की है ।
कार्यरत MBR प्रणाली की क्षमताओं पर निर्भर करते हुए, इसी खेती प्रोटोकॉल अलग होगा । उदाहरण के लिए, यदि बायोमास गठन की कोई ऑनलाइन माप उपलब्ध है, यह वृद्धि प्रयोग के पूरा होने के बाद बायोमास एकाग्रता को मापने के लिए पर्याप्त हो सकता है । पीएच और भंग ऑक्सीजन, जो कई MBR प्रणालियों में लागू किया जाता है की ऑनलाइन निगरानी के साथ संयोजन में, विकास संतृप्ति सुरक्षित रूप से निर्धारित कर सकते हैं । सिद्धांत रूप में, विकास प्रयोगों MTPs अकेले में आयोजित किया जा सकता है मिलाते हुए मशीन के अंदर रखा, एक MBR प्रणाली के उपयोग के बिना । इस मामले में, उचित खेती की स्थितियों को सुनिश्चित किया जाना है: (1) ऑक्सीजन-सीमित खेती उचित geometries के साथ संयोजन में उपयुक्त मिलाते हुए आवृत्तियों के साथ MTPs का उपयोग करके बचा जा सकता है और व्यास मिलाते हुए, उदा, स्क्वायर ९६ या 24 गहरी खैर 3 मिमी पर १,००० rpm पर संचालित प्लेटें फेंक या २५० rpm पर 25 mm फेंक, क्रमशः । महत्वपूर्ण बात, कम प्राप्त अधिक से अधिक ऑक्सीजन हस्तांतरण दर, कम मुख्य कार्बन स्रोत केंद्रित किया जाना चाहिए । जैसा कि ऊपर बताया गया है, इस अध्ययन के लिए, 10 ग्राम/एल ग्लूकोज का उपयोग नियोजित खेती की स्थिति के लिए ऑक्सीजन सीमा को रोकने के लिए उपयुक्त था; (२) बायोमास और उत्पाद ठहराव के लिए एमटीपी संस्कृतियों की सैंपलिंग कम से न्यूनतम की जानी चाहिए. हर बार एमटीपी मिलाना मशीन से हटा दिया जाता है, ऑक्सीजन हस्तांतरण तुरंत टूट जाएगा जो प्रतिकूल खेती की स्थिति में परिणाम हो सकता है; (३) लेखकों की राय में, खेती के उपकरणों के रूप में एमटीपी पाठकों का उपयोग अनुशंसित नहीं है क्योंकि इन उपकरणों को इस प्रयोजन के लिए विकसित नहीं किया गया था. उदाहरण के लिए, मिलाते यांत्रिकी microplates के कभी कभार मिश्रण के लिए बनाया गया है और इस तरह के बाद, अक्सर लगातार मिलाने के लंबे समय के लिए मजबूती कमी दिनों के लिए स्थाई मिलाते हुए । इसके अलावा, माइक्रोबियल खेती के लिए आवश्यक पर्याप्त शक्ति इनपुट इन पाठकों में महसूस नहीं किया जा सकता है । कम समय अंतराल में ऑप्टिकल घनत्व रीडिंग के एकीकरण मिलाते हुए गति की रोक की आवश्यकता है, ऑक्सीजन सीमा की दोहराया अवधि में जिसके परिणामस्वरूप. इसके अलावा, लंबी खेती के समय इस तरह की प्रणालियों में वाष्पीकरण परिणाम विकृत हो जाएगा । माइक्रोबियल खेती के लिए MTPs के प्रयोग पर आश्चर्यजनक जटिल विषय पर अधिक जानकारी के लिए, पाठक उद्धृत साहित्य के लिए भेजा है22,23,24,25,26 और उसमें सन्दर्भ.
आगे विचार
गति-अप चलने ऑप्टिमाइज़ेशन चरणों के लिए, यह ध्यान से उत्पाद ठहराव के लिए विश्लेषणात्मक विधि का चयन करने के लिए सलाह दी जाती है । चलने प्रयोगात्मक डिजाइन रणनीति प्रयोगात्मक अशुद्धि बर्दाश्त के रूप में तेजी से और सरल तरीके परिशुद्धता और सटीकता की लागत पर पसंद किया जाना चाहिए । हालांकि, अंतिम परिणाम पर्याप्त सटीक और सटीक उत्पाद ठहराव तरीकों कि अधिक जटिल हो सकता है के खिलाफ सत्यापित किया जाना चाहिए । सामांय में, सावधान मूल्यांकन और अध्ययन प्रक्रियाओं के बारे में निर्णय लेने के अध्ययन की शुरुआत में प्रयास की आवश्यकता है, लेकिन लंबे समय में भुगतान करते हैं, के बाद नियमित तरीकों की स्थापना की गई है ।
यह उच्च अनुकूलन के दौरान सभी प्रयोगों की तुलना में है कि एक संदर्भ प्रयोग को परिभाषित करने के लिए सिफारिश की है. यही कारण है कि, लागू मध्यम घटक सांद्रता के रूप में के रूप में अच्छी तरह से मापा उत्पादन संदर्भ मूल्यों से विभाजन के माध्यम से सामान्यीकृत हैं । इस तरह, प्रत्येक लागू किए गए और मापा मान संदर्भ मान के x-फ़ोल्ड के रूप में समझा जा सकता है । प्लेटों के बीच भिन्नता को ध्यान में रखने के लिए, प्रत्येक प्लेट पर पांच संदर्भ प्रयोग किए जाते हैं । मापा परिणाम का माध्य मान सामान्यीकरण के लिए उपयोग किया जाता है ।
यह आम तौर पर गारंटी नहीं किया जा सकता है कि विकसित माध्यम भी अंय उपभेदों के लिए इष्टतम है । हालांकि, सुधार माध्यम सबसे अधिक संभावना भी छोटे आनुवंशिक मतभेदों के साथ अभिव्यक्ति उपभेदों खेती के लिए उपयुक्त होगा, जैसे, जब एकल एमिनो एसिड mutagenesis अध्ययन से प्राप्त प्रतिस्थापन के साथ एंजाइम वेरिएंट का निर्माण ( हालांकि एक भी बिंदु उत्परिवर्तनों सेलुलर चयापचय और heterologous अभिव्यक्ति प्रदर्शन५५,५६) प्रभाव के लिए वर्णित किया गया है । इस स्थिति में, प्रस्तुत प्रोटोकॉल एक पहला चरण, उच्च-प्रवाह अभिव्यक्ति screenings५७के लिए प्रोटोकॉल द्वारा पीछा किया जा सकता है । यदि प्रोटोकॉल अनुवर्ती स्केल-फेड के लिए बैच खेती के साथ मध्यम विकास के लिए प्रयोग किया जाता है, अनुकूलित मध्यम इसी प्रक्रिया की स्थिति के लिए सत्यापित किया जाना चाहिए, अतिसूक्ष्म पर क्लोन स्क्रीनिंग अभियानों के रूप में विभिंन शीर्ष पहचान विभिंन खिला रणनीतियों और खेती मीडिया५२,५८के लिए कलाकारों । इसके अलावा, शुरू KriKit३६ आम तौर पर बेहतर समग्र प्रक्रिया अनुकूलन में योगदान कर सकते हैं ।हाल ही में, उपकरण क्षमताओं को भी बहु का समर्थन उद्देश्य अनुकूलन४०, जो दोनों नदी के नीचे और बहाव प्रक्रियाओं को अनुकूलित५९,६०के लिए महत्वपूर्ण हो सकता है विस्तारित किया गया ।
The authors have nothing to disclose.
NRW-Strategieprojekt BioSC (No. 313/323-400-002 13) के ढांचे के भीतर अनुसंधान के वैज्ञानिक गतिविधियों को आर्थिक रूप से नवाचार, विज्ञान मंत्रालय द्वारा वित्तीय रूप से समर्थन किया गया है, और शोध । लेखक नवाचार, विज्ञान मंत्रालय का धंयवाद, और उत्तर राइन के अनुसंधान-Westphalia और हेनरिक Heine विश्वविद्यालय डसेलडोर्फ लार्स के भीतर Freier CLIB के लिए एक छात्रवृत्ति के लिए-स्नातक क्लस्टर औद्योगिक जैव प्रौद्योगिकी । इसके अलावा धन को सक्षम करने से प्राप्त किया गया था रिक्त स्थान कार्यक्रम “Helmholtz अभिनव लैब्स” जर्मन Helmholtz एसोसिएशन के “माइक्रोबियल जैविक प्रक्रिया लैब-एक Helmholtz नवाचार लैब” का समर्थन करने के लिए ।
BioLector | m2p-labs | G-BL-100 | |
Flowerplate | m2p-labs | MTP-48-BOH | For cultivation in the BioLector device |
Sealing foil | m2p-labs | F-GP-10 | Sterile sealing for Flowerplate |
MATLAB | Mathworks | 2016b | |
KriKit | Forschungszentrum Jülich | n/a | Freely available, MATLAB installation required |
Janus pipetting robot | Perkin Elmer | n/a | Includes "WinPrep" software installation |
12-column deep well microplate | E&K Scientific | EK-2034 | Container for medium stock solutions |
96 well microplates, transparent, F-bottom | Greiner | 655101 | For Bradford protein assay |
µclear 96 well microplates, black body, transparent F-bottom | Greiner | 655087 | For flourescence measurement in cell-free supernatants |
Pipette Research plus multi-channel pipettes | Eppendorf | n/a | Facilitates manual liquid handling with microplates |
TruPAG Precast Gels | Sigma | PCG2002 | For SDS-Page analysis of cell-free supernantants |
Bradford Reagent | Sigma | B6916 | |
C. glutamicum pCGPhoDBs-GFP | n/a | n/a | Carries pEKEx2 plasmid with fusion of GFP gene and PhoD signal peptide from B.subtilis as expression insert. Plasmid provides kanamycin resistance. Described and published by Meissner et al. Appl Microbiol Biotechnol 76 (3), 633–42 (2007) |