透過型電子顕微鏡における微生物の連続超薄切片を得る方法
Summary
本研究は、透過型電子顕微鏡の高価な機器なし微生物の連続超薄切片を得るため信頼性が高く、簡単な手順を示します。
Abstract
細胞と細胞成分を透過型電子顕微鏡の高倍率で 3 次元観察試料の超薄切片を準備する必要があります。連続超薄切片の準備は非常に困難であると考えられている適切な方法を使用する場合より簡単です。本稿では微生物の連続超薄切片を安全に取得するためのステップバイ ステップの手順を紹介します。このメソッドの重要なポイントは、: 1) 標本の大部分を使用し、互いに平行になるので、試料の表面とナイフのエッジを調整するには2) グループの連続切片をカット、スリット格子; に連続切片のグループを取得するときに髪の毛のペアを使用してセクションを分離することの難しさを避けるために3) ‘セクション保持ループ’ を使用してセクション グループの順序を混合しないように4)「水表面調達ループ」を使用してセクションは水頂点に配置され、こと; グリッドの目的の位置に配置するためのグリッドを最初タッチを確認するには5) アルミ ラック支持フィルムを使用し、容易にグリッド上のセクションを回復するしサポート フィルムのしわを避けるために・ 6) 染色チューブを使用し、誤ってピンセットでサポート フィルムを破ることを避けます。この新しいメソッドは、難なく連続超薄切片を取得できます。メソッドは、自動テープ収集ウルトラミクロトーム メソッドとシリアル ブロック顔または集束イオンビーム走査電子顕微鏡を使用して達成することができない、3 D の高解像度で微生物の細胞構造を解析することが可能になります。
Introduction
適切なシリアル極薄断面法は細胞および三次元電子顕微鏡レベルでの細胞成分の研究に不可欠であります。酵母細胞の細胞周期におけるスピンドル極体のダイナミクスを検討し、, 細胞周期と重複1,2,3,の時間の間に彼らの微細構造の形態学的変化を明らかにいる4,5。2006 年に「構造」を組み合わせることで新しい単語 ‘ストラクトーム」を造語と ‘-青梅 ‘、’構造情報、電子顕微鏡レベルで全体細胞の、定量的および三次元’ 6,7として定義。
シリアルの極薄断面法を必要とするストラクトーム解析による酵母とExophiala dermatitidisの酵母細胞が約 200,000 リボゾーム7、8、を持っていたことがわかった。大腸菌セル 26,000 リボゾーム9、結核菌細胞いた 1,700 リボゾーム10明神らせん状細菌のみ 300 リボゾーム11を持っていた。この情報だけでなく各有機体、9種の同定にも成長率の推定に役に立ちます。
さらに、ストラクトーム解析; 新しい有機体の発見につながったParakaryon myojinensisは、細胞構造が原核生物と真核生物12,13,14,15の間中間日本の海岸沖の深海で発見されました。現時点では、シリアルの極薄断面法マスターに長い時間がかかるので困難であると見なされます。本研究では難なく極薄シリアルセクショニングを実行できます誰も信頼性の高い方法を開発しました。
Protocol
注: この研究で使用される標本は、プロパンと液体窒素で急速凍結された微生物を凍結置換アセトン 2% オスミウム四酸化二を含むとエポキシ樹脂1,2,3、埋め込み 4,5,6,7,8,9<…
Representative Results
このプロトコルでは、3 スリット格子は連続切片を拾うために使用されていました。グリッドは、ニッケルや銅の作られています。連続切片は、真ん中のスリットに配置されます。両側スリットは、グリッドとそれらを拾うときにセクションを表示する必要があります。グリッド連続切片と平行するときしてピンセット (図 11 d) でそれらを拾い?…
Discussion
ここで紹介した方法は、高価な機器を必要としません。染色管 (図 13)、水表面を上げるループ (図 11 a)、ループ セクションを保持 (図 10 a) 3 スリット グリッド (図 6 c) アルミ ラック (図 3) のみが必要です。現在のメソッドの多くの機能があります。標本の大部分は、互いに平行に?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
我々 は心から彼の貴重な提案や議論の茂雄北をありがちましょう。我々 はまた原稿の彼らの重要な読書のジョンとすみれエクスタインをありがちましょう。
Materials
| Formvar making apparatus | Nisshin EM Co. Ltd., Tokyo | 652 | W 180 x D 180 x H 300 mm |
| Glass slide | Matsunami Co. Ltd., Osaka | – | 76 x 26 x 1.3 mm |
| Aluminum rack with 4-mm holes | Nisshin EM Co. Ltd., Tokyo | 658 | W 30 x D 25 x H 3 mm, Refer to this paper |
| Stereomicroscope | Nikon Co. Ltd., Tokyo | – | SMZ 645 |
| LED illumination for stereomicroscope | Nikon Co. Ltd., Tokyo | – | SM-LW 61 Ji |
| Trimming stage | Sunmag Co.Ltd., Tokyo | – | Tilting mechanism equipped, Refer to this paper |
| LED illumination for trimming stage | Sunmag Co.Ltd., Tokyo | – | Refer to this paper |
| Ultrasonic trimming blade | Nisshin EM Co. Ltd., Tokyo | 5240 | EM-240, Refer to this paper |
| Diamond knife for trimming | Diatome Co. Ltd., Switzerland | – | 45° |
| Diamond knife for ultrathin sectioning | Diatome Co. Ltd., Switzerland | – | 45° |
| Ultramicrotome | Leica Microsystems, Vienna | – | Ultracut S |
| Mesa cut | Leica Microsystems, Vienna | – | Mirror |
| 0.5% Neoprene W solution | Nisshin EM Co. Ltd., Tokyo | 605 | |
| Special 3-slit nickel grid | Nisshin EM Co. Ltd., Tokyo | 2458 | Refer to this paper |
| Special 3-slit copper grid | Nisshin EM Co. Ltd., Tokyo | 2459 | Refer to this paper |
| Section-holding loop | Nisshin EM Co. Ltd., Tokyo | 526 | Refer to this paper |
| Water-surface-raising loop | Nisshin EM Co. Ltd., Tokyo | 527 | Refer to this paper |
| Staining tube | Nisshin EM Co. Ltd., Tokyo | 463 | Refer to this paper |
| Multi-specimen holder | JEOL Co. Ltd., Tokyo | – | EM-11170 |
| JEM-1400 | JEOL Co. Ltd., Tokyo | – | Transmission electron microscope |
Referências
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Citar este artigo
Yamaguchi, M., Chibana, H. A Method for Obtaining Serial Ultrathin Sections of Microorganisms in Transmission Electron Microscopy. J. Vis. Exp. (131), e56235, doi:10.3791/56235 (2018).