Mitocondriale di Ca2 + ritenzione capacità Assay e Ca2 +-innescato gonfiamento mitocondriale Assay

Summary

Questo protocollo ha lo scopo di descrivere un metodo per esaminare la capacità di ritenzione di Ca^{2 +} e Ca^{2 +}– innescato mitocondriale gonfiore di mitocondri isolati di SH-SY5Y cellule passo-passo.

Abstract

La produzione di ATP da fosforilazione ossidativa è la funzione primaria dei mitocondri. I mitocondri negli eucarioti superiori partecipano anche Ca citosolico^{2 +} buffer, e la produzione di ATP in mitocondriale può essere mediata da intramitochondrial Ca^{2 +} concentrazione libera. Capacità di ritenzione di CA^{2 +} può essere considerata come la capacità dei mitocondri di trattenere calcio nella matrice mitocondriale. Accumulato intracellulare Ca^{2 +} conduce alla permeabilità della membrana mitocondriale interna, definito l’apertura del poro di transizione di permeabilità mitocondriale (mPTP), che conduce alla perdita di molecole con un molecolare peso meno di 1,5 kDa. CA^{2 +}-innescato mitocondri gonfiore viene utilizzato per indicare l’apertura di mPTP. Qui, descriviamo due saggi per esaminare la capacità di ritenzione di Ca^{2 +} e Ca^{2 +}-innescato gonfiamento mitocondriale in mitocondri isolati. Dopo determinate quantità di Ca^{2 +} vengono aggiunti, tutti i passaggi possono essere completati in un giorno e registrati da un lettore di micropiastre. Così, queste due analisi semplice ed efficace possono essere adottate per valutare il Ca^{2 +}-relative funzioni mitocondriali.

Introduction

I mitocondri sono i principali organi cellulari per produrre quasi il 95% del trifosfato di adenosina usato nelle cellule dei mammiferi di fosforilazione ossidativa. È stato riferito che la concentrazione micromolar sequestrata di Ca^{2 +} dai mitocondri, la presenza di ADP e fosfato inorganico può essere utilizzato per fosforilare ADP a sintesi ATP¹. Quando la concentrazione di Ca citosolico^{2 +} supera una soglia, i mitocondri possono l’assorbimento di Ca^{2 +} rapidamente e di efflusso e lentamente. Così, i mitocondri di funzionamento possono afflusso l’aumento citosolico Ca^{2 +}. Irrilevante per la partecipazione nella fosforilazione ossidativa, il mitocondriale Ca^{2 +} anche partecipare i segnali di calcio citosolico e attivare il meccanismo apoptotico mitocondriale inducendo l’apertura della mPTP nella parte interna mitocondriale membrana². È stato ampiamente riconosciuto che l’elevazione anormale del intracellulare di Ca^{2 +} può indurre mitocondriale gonfiamento voluminoso aprendo il mPTP³. Così, questo protocollo ha lo scopo di valutare la funzione mitocondriale di quantificare la capacità di ritenzione mitocondriale Ca^{2 +} e Ca^{2 +}-innescato gonfiamento mitocondriale.

Capacità di ritenzione di CA^{2 +} è la misura della capacità dei mitocondri di calcio citosolico di assorbimento. I mitocondri possono buffer il calcio libero citosolico e regolano i processi cellulari di calcio-dipendente dall’assorbimento di calcio sotto forma di precipitati inattivi. Capacità di ritenzione alterata Ca^{2 +} si verifica nei fenomeni di stress associati a limitazione di energia e anche neurodegenerative malattie^4,5. Mitocondri isolati o cellule della digitonina-permeabilized possono essere utilizzate per identificare la capacità di ritenzione di Ca^{2 +} , e l’elevata capacità di accumulare Ca^{2 +} di mitocondri isolati con il glutammato additonal e malate non avviene mediante il isolamento mitocondriale procedura⁶. Una quantità di Estratto titolata di digitonina deve essere utilizzata per permeabilize le membrane del plasma di diversi tipi di cellule. Il sale di hexapotassium di Ca^{2 +}-associazione tintura fluorescente verde, Ca^{2 +}-indicatore luce-eccitabile visibile cellula-impermeant sensibile, è stato ampiamente usato⁷. CA^{2 +}-associazione verde colorante fluorescente è un indicatore di bassa affinità e utilizzati per dimostrare che intracellulare Ca^{2 +} le concentrazioni libere di continuare ad aumentare durante prolungato di stimolazioni (5 min)⁸. Questo metodo era meno sensibile che la tecnica di filtro radioattivo, ma è stato notevolmente semplificato. Ulteriori Ca^{2 +} eleva fluorescenza verde di calcio e l’assorbimento di Ca^{2 +} dai mitocondri ritorna la fluorescenza ai valori basali. Fino a quando i mitocondri non è riuscito a assorbimento extramitochondrial Ca^{2 + 9}, sono state fatte aggiunte sequenziale di Ca^{2 +} . Un lettore di micropiastre di fluorescenza può essere utilizzato per segnalare continuamente la fluorescenza verde di calcio.

Dopo Ca^{2 +} accumulo, mitocondri depolarizzarono, scaricata Ca^{2 +} nel terreno e ha cominciato a gonfiarsi. CA^{2 +}-innescato mitocondri gonfiore viene utilizzato per indicare l’apertura di mPTP. La microscopia elettronica e la diminuzione di luce assorbanza a 540 nm può essere usato per misurare il Ca^{2 +}-innescato mitocondriale gonfiore^10,11. Volume di mitocondri può essere determinata direttamente da angolo in avanti dispersione della luce¹², dove diminuisce di assorbanza riflettono passiva gonfiore della matrice mitocondriale.

Qui, vi illustriamo la metodologia per esaminare la capacità di ritenzione mitocondriale Ca^{2 +} e Ca^{2 +}-innescato gonfiamento mitocondriale in mitocondri isolati da cellule SH-SY5Y.

Protocol

1. isolamento dei mitocondri Nota: Tutte le soluzioni e apparecchiature dovrebbe essere preraffreddate a 0 – 4 ° C e tenute su ghiaccio. Seme circa 3 x 106 SH-SY5Y cellule per piastra di coltura delle cellule di 10 cm. Cellule di cultura in alto-glucosio Dulbecco s modified medium di Eagle con 10% siero bovino fetale, penicillina (100 U/mL)-streptomicina (100 µ g/mL). Mantenere a 37 ° C in un incubatore contenente 5% CO2 durante la notte.Nota: almeno 1-2 …

Representative Results

Rappresentante risultati di Ca2 + capacità di ritenzione:Risultati sono stati espressi come valori di fluorescenza. Con gli ulteriori impulsi del Ca2 + (200 proteina mitocondriale nmols/mg), la fluorescenza aumentata del doppio di sopra della linea di base con l’apertura di mPTP. 5 μM Bongkrekate (BKA), un inibitore di Ca2 +-indotto mPTP apertura, o 1 μM atractyloside (ATR), un attivatore di Ca2 +-indotto mPTP apertura, sono stat…

Discussion

Qui, abbiamo descritto un protocollo semplice ed efficace per il mitocondriale Ca^{2 +} ritenzione capacità dosaggio e Ca^{2 +}-attivato dosaggio gonfiamento mitocondriale.

Per l’isolamento mitocondriale, assicurarsi che tutti i materiali e i tubi sono sul ghiaccio, soprattutto quando le cellule di omogeneizzazione. 0,25% tripsina-EDTA può essere utilizzato anche per staccare le cellule dal piatto per 5 min a 37 ° C. Dopo 15-25 colpi, è necessario osservare la membrana dell…

Materials

SH-SY5Y cell line	ATCC (The Global Bioresource Center)	ATCC Number: CRL-2266
Calcium green-5N	Life Technologies	c-3737	Ca2+-binding green fluorescent dye
complete protease inhibitors	Roche Molecular Biochemicals	4693116001
glass homogenizer	Kimble Chase	9885303002
glutamate	Sigma-Aldrich	RES5063G-A7
malate	Sigma-Aldrich	46940-U
rotenone	Sigma-Aldrich	R8875
HEPES	Sigma-Aldrich	H3375
MgCl2	Sigma-Aldrich	00457
K2HPO4	Sigma-Aldrich	V900050
KCl	Sigma-Aldrich	P9541
CaCl2	Sigma-Aldrich	V900266
Varioskan flash instruments	Thermo Scientific	IC100E
Bongkrekate	Biovision	1820-100
atractyloside	Sigma-Aldrich	C4992
high-glucose Dulbecco’s modified Eagle medium	Hyclone	SH30022	4.5 g/L glucose, L-glutamine, without sodium pyruvate
fetal bovine serum	Hyclone	SV30087
penicillin	Sigma-Aldrich	P3032
streptomycin	Invitrogen	11860-038
BCA assay kit	Thermo Scientific	NCI3225CH
PBS	Hyclone	SH30256.01
10 cm cell culture dish	NEST	704001