미토 콘 드 리아 캘리포니아2 + 보존 용량 분석 결과 및 캘리포니아2 +-미토 콘 드 리아 붓기 분석 결과 발생

Summary

이 프로토콜 Ca^{2 +} 보존 용량 및 캘리포니아^{2 +}검사 하는 방법을 설명 하는 것을 목표로-트리거 SH-SY5Y의 고립 된 미토 콘 드리 아의 붓기 미토 콘 드리 아 세포 단계.

Abstract

산화 인 산화에 의해 ATP의 생산은 미토 콘 드리 아의 주 기능은 이다. 더 높은 진핵생물의 미토 콘 드리 아도 참여할 cytosolic 캘리포니아^{2 +} 버퍼링, 그리고 미토 콘 드리 아에서 ATP 생산 intramitochondrial 무료 캘리포니아^{2 +} 농도 의해 중재 될 수 있다. 캘리포니아^{2 +} 보존 용량 미토 콘 드 리아 매트릭스에 칼슘을 유지 하는 미토 콘 드리 아의 기능으로 간주 될 수 있습니다. 축적 된 세포내 캘리포니아^{2 +} 리드 안 미토 콘 드리 아 막의 침투성을 미토 콘 드리 아 침투성 전환 기 공 (mPTP)는 분자와 분자의 유출에는 리드 무게 1.5 kDa의 개통 되 나. 캘리포니아^{2 +}-트리거 미토 콘 드리 아 붓기 mPTP 개방을 나타내는 데 사용 됩니다. 여기, 우리가 설명 하는 Ca^{2 +} 보존 용량 및 캘리포니아^{2 +}검사를 두 분석-고립 된 미토 콘 드리 아에서 미토 콘 드리 아 붓기를 트리거. 특정 양의 캘리포니아^{2 +} 추가 후 모든 단계는 하루에 완료 고 microplate 리더에 의해 기록 될 수 있습니다. 따라서,이 두 가지 간단 하 고 효과적인 분석 평가 Ca^{2 +}채택 될 수-미토 콘 드 리아 기능 관련.

Introduction

미토 콘 드리 아 ATP 산화 인 산화에 의해 포유류 세포에서 사용의 거의 95%를 생산 주요 세포 기관 이다. 그것은 그의 캘리포니아^{2 +} 미토 콘 드리 아에 의해 분리 된 micromolar 집중, ADP와 무기 인산 염의 존재를 사용할 수 있는 합성 ATP¹ADP phosphorylate 보고. Cytosolic 캘리포니아^{2 +} 의 농도 임계값 이상 되 면 미토 콘 드리 아 수 이해 캘리포니아^{2 +} 급속 하 게 경과 하 고 그것은 천천히. 따라서, 작동 미토 콘 드리 아 수 유입 증가 cytosolic 캘리포니아^{2 +}. 없는 산화 인 산화에 참여 하는 미토 콘 드 리아 Ca^{2 +} 또한 cytosolic 칼슘 신호에 참여 및 미토 콘 드리 아 내에는 mPTP의 개방을 유도 하 여 미토 콘 드 리아 apoptotic 메커니즘을 활성화 막². 그것은 널리 인정 되었습니다 세포내 캘리포니아^{2 +} 의 비정상적인 상승 mPTP³여 미토 콘 드리 아 대규모 붓기를 일으킬 수 있다. 따라서,이 프로토콜 미토 콘 드 리아 캘리포니아^{2 +} 보존 용량 및 캘리포니아^{2 +}측정 하 여 미토 콘 드리 아 기능을 평가 하는 것을 목표로-유혹 trigged 미토 콘 드 리아 붓기.

캘리포니아^{2 +} 보존 용량 글귀 cytosolic 칼슘을 미토 콘 드리 아의 능력의 측정입니다. 미토 콘 드리 아 무료 cytosolic 칼슘을 버퍼링 하 고 비활성 침전의 형태로 칼슘 통풍 관에 의해 칼슘-의존 세포질 과정을 조절 수 있습니다. 장애인된 캘리포니아^{2 +} 보존 용량 에너지 제한 및 심지어 neurodegenerative 질병^4,5와 관련 된 스트레스 현상에서 발생 합니다. 고립 된 미토 콘 드리 아 또는 셀 digitonin permeabilized Ca^{2 +} 보존 용량, 식별 하는 데 수 고 축적 캘리포니아^{2 +} 추가 조미료와 malate 고립 된 미토 콘 드리 아에 의해 상승 된 능력에 의해 영향을 받지는 합니다 미토 콘 드리 아 격리 절차⁶. 적정 한 양의 digitonin 플라즈마 막 종류의 다른 세포를 permeabilize를 사용 해야 합니다. 캘리포니아^{2 +}의 hexapotassium 소금-녹색 형광 염료, 캘리포니아^{2 +}바인딩-민감한 셀 impermeant 표시 빛 고르기 표시기, 널리⁷되었습니다. 캘리포니아^{2 +}-(5 분) stimulations⁸연장 바인딩 녹색 형광 성 염료는 낮은 선호도 표시기 이며 무료 세포내 캘리포니아^{2 +} 농도 동안 상승 계속 표시 하는 데 사용. 이 방법은 방사성 필터 기법 보다 덜 민감한 하지만 매우 간단 하 게 했다. 추가 Ca^{2 +} 칼슘 녹색 형광을 끌어올리고 고 미토 콘 드리 아에 의해 Ca^{2 +} 통풍 관 기준선에 형광을 반환 합니다. 캘리포니아^{2 +} 의 순차적 추가 mitochondria 통풍 관 extramitochondrial Ca^{2 + 9}실패까지 했다. 형광 microplate 리더는 지속적으로 칼슘 녹색 형광을 보고 사용할 수 있습니다.

캘리포니아^{2 +} 축적, 후 미토 콘 드리 아 depolarized, 캘리포니아^{2 +} , 매체에 발표 고 팽창 하기 시작 했다. 캘리포니아^{2 +}-트리거 미토 콘 드리 아 붓기 mPTP 개방을 나타내는 데 사용 됩니다. 전자 현미경 및 측정 캘리포니아^{2 +}데 540 nm 수에 빛 흡 광도 감소-미토 콘 드 리아 붓기^10,11을 실행. 앞으로 각 산란¹², 흡수도 감소 미토 콘 드 리아 매트릭스의 수동 붓기를 반영 미토 콘 드리 아 볼륨을 직접 확인할 수 있습니다.

여기, 우리는 미토 콘 드 리아 캘리포니아^{2 +} 보존 용량 및 캘리포니아^{2 +}검사 방법론 설명-SH-SY5Y 세포에서 고립 된 미토 콘 드리 아에서 미토 콘 드리 아 붓기를 트리거.

Protocol

1입니다. 미토 콘 드리 아의 격리 참고: 모든 솔루션 및 장비 0-4 ° C에 precooled와 있어야 얼음에 보관 합니다. 10 cm 세포 배양 접시 당 종자 약 3 x 106 SH SY5Y 셀. 높은 포도 당 Dulbecco에 문화 세포의 10% 태아 둔감 한 혈 청, 페니실린 (100 U/mL)와 글 중간을 수정-스 (100 µ g/mL). 밤새 5% CO2 를 포함 하는 인큐베이터에서 37 ° C에서 유지 합니다.참고: 107 SH …

Representative Results

캘리포니아2 + 보존 용량의 대표 결과:결과 형광 값으로 표현 되었다. 캘리포니아2 + (200 nmols/mg 미토 콘 드리 아 단백질)의 더블 mPTP 오프닝 베이스 위에 증가 하는 형광의 추가 펄스와. 5 μ M Bongkrekate (BKA), 캘리포니아2 +의 억제제-mPTP 개방, 또는 1 μ M atractyloside (ATR), 캘리포니아2 +의 활성 유도-mPTP 개방을 유도, 고립 된 미토 콘 드리 …

Discussion

여기, 우리는 미토 콘 드 리아 캘리포니아^{2 +} 보존 용량 분석 결과 및 캘리포니아^{2 +}에 대 한 간단 하 고 효과적인 프로토콜을 설명-미토 콘 드 리아 붓기 분석 결과 유발.

미토 콘 드리 아 격리에 대 한 모든 자료와 튜브는 얼음, 특히 때 세포 조직 확인 하십시오. 37 ° c.에 5 분 동안 접시에서 세포를 분리 하 0.25% trypsin EDTA는 사용할 수 있습니다. 후에 15-25 선, 그?…

Materials

SH-SY5Y cell line	ATCC (The Global Bioresource Center)	ATCC Number: CRL-2266
Calcium green-5N	Life Technologies	c-3737	Ca2+-binding green fluorescent dye
complete protease inhibitors	Roche Molecular Biochemicals	4693116001
glass homogenizer	Kimble Chase	9885303002
glutamate	Sigma-Aldrich	RES5063G-A7
malate	Sigma-Aldrich	46940-U
rotenone	Sigma-Aldrich	R8875
HEPES	Sigma-Aldrich	H3375
MgCl2	Sigma-Aldrich	00457
K2HPO4	Sigma-Aldrich	V900050
KCl	Sigma-Aldrich	P9541
CaCl2	Sigma-Aldrich	V900266
Varioskan flash instruments	Thermo Scientific	IC100E
Bongkrekate	Biovision	1820-100
atractyloside	Sigma-Aldrich	C4992
high-glucose Dulbecco’s modified Eagle medium	Hyclone	SH30022	4.5 g/L glucose, L-glutamine, without sodium pyruvate
fetal bovine serum	Hyclone	SV30087
penicillin	Sigma-Aldrich	P3032
streptomycin	Invitrogen	11860-038
BCA assay kit	Thermo Scientific	NCI3225CH
PBS	Hyclone	SH30256.01
10 cm cell culture dish	NEST	704001