Mitocondrial de Ca2 + retención capacidad análisis y Ca2 +-activa hinchazón mitocondrial ensayo

Summary

Este protocolo tiene por objeto describir un método para examinar la capacidad de retención de Ca^{2 +} y Ca^{2 +}– activa hinchazón de mitocondrias aisladas de SH-SY5Y mitocondrial de células paso a paso.

Abstract

La producción de ATP por fosforilación oxidativa es la función principal de las mitocondrias. Las mitocondrias en los eucariotas superiores también participarán en citosólica Ca^{2 +} buffering, y la producción de ATP en mitocondrial puede estar mediada por intramitochondrial gratis Ca^{2 +} concentración. Capacidad de retención de CA^{2 +} puede considerarse como la capacidad de las mitocondrias para retener el calcio en la matriz mitocondrial. Acumulación intracelular Ca^{2 +} lleva a la permeabilidad de la membrana mitocondrial interna, como la apertura del poro de transición de permeabilidad mitocondrial (mPTP), que conduce a la salida de moléculas con un molecular peso menos de 1.5 kDa. CA^{2 +}-activa las mitocondrias hinchazón se utiliza para indicar la apertura del mPTP. Aquí, Describimos dos ensayos para examinar la capacidad de retención de Ca^{2 +} y Ca^{2 +}-activa hinchazón mitocondrial en las mitocondrias aisladas. Después de ciertas cantidades de Ca^{2 +} se ha añadido, todos los pasos pueden ser completados en un día y registrados por un lector de microplacas. Por lo tanto, pueden adoptarse estos dos análisis simples y eficaces para evaluar el Ca^{2 +}-relacionadas con las funciones mitocondriales.

Introduction

Las mitocondrias son los principales órganos celulares que producen casi el 95% de la ATP que se utiliza en las células de mamífero por fosforilación oxidativa. Se informó que el secuestrado concentración micromolar de Ca^{2 +} por las mitocondrias, la presencia de ADP y fosfato inorgánico puede utilizarse para fosforilan ADP síntesis ATP¹. Cuando la concentración citosólica Ca^{2 +} por encima de un umbral, las mitocondrias pueden absorción de Ca^{2 +} rápidamente y eflujo poco a poco. Así pues, el funcionamiento de la mitocondria puede afluencia el aumento citosólico Ca^{2 +}. Irrelevante para la participación en la fosforilación oxidativa, la mitocondrial Ca^{2 +} también tomar parte en las señales de calcio citosólico y activar el mecanismo de apoptosis mitocondrial al inducir la apertura de la mPTP en el interior mitocondrial membrana². Ha sido ampliamente reconocida que elevación anormal de Ca intracelular^{2 +} puede inducir inflamación masiva mitocondrial por la apertura del mPTP³. Así, este protocolo tiene como objetivo evaluar la función mitocondrial mediante la cuantificación de la mitocondrial Ca^{2 +} capacidad de la retención y Ca^{2 +}-trigged hinchazón mitocondrial.

Capacidad de retención de CA^{2 +} es la medida de la capacidad de las mitocondrias de calcio citosólico de absorción. Las mitocondrias pueden búfer el calcio libre citosólico y regulan procesos celulares dependientes de calcio por la absorción de calcio en forma de precipitados inactivos. Deterioro capacidad de Ca^{2 +} retención ocurre en fenómenos de estrés asociados con limitación de energía e incluso neurodegenerativas enfermedades^4,5. Permeabilized digitonin células o mitocondrias aisladas se pueden utilizar para identificar la capacidad retención de Ca^{2 +} , y la elevada capacidad para acumular Ca^{2 +} por mitocondrias aisladas con el glutamato adicional y malato no es afectada por la Aislamiento mitocondrial procedimiento⁶. Debe utilizarse una cantidad pretitulada de digitonin a permeabilizar las membranas del plasma de diferentes tipos de células. La sal de hexapotassium de Ca^{2 +}-enlace colorante fluorescente verde, un Ca^{2 +}-indicador excitable luz visible célula impermeant sensible, ha sido ampliamente utilizado⁷. CA^{2 +}-encuadernación verde colorante fluorescente es un indicador de baja afinidad y se utiliza para mostrar que intracelular libre Ca^{2 +} las concentraciones siguen aumentando durante prolongado (5 min) estímulos⁸. Este método fue menos sensible que la técnica de filtros radiactivos pero fue simplificado grandemente. El adicional Ca^{2 +} eleva la fluorescencia verde de calcio y la absorción de Ca^{2 +} por mitocondrias devuelve la fluorescencia a línea de fondo. Se hicieron adiciones secuenciales de Ca^{2 +} hasta que la mitocondria no absorción extramitochondrial Ca^{2 + 9}. Un lector de microplacas de fluorescencia puede utilizarse para informar continuamente la fluorescencia verde de calcio.

Después de la acumulación de Ca^{2 +} , mitocondrias despolarizado, liberan Ca^{2 +} en el medio y comenzaron a hincharse. CA^{2 +}-activa las mitocondrias hinchazón se utiliza para indicar la apertura del mPTP. La microscopia electrónica y la disminución ligera absorbancia a 540 nm puede usarse para medir la Ca^{2 +}-activa de^10,hinchazón mitocondrial¹¹. Volumen de las mitocondrias puede determinarse directamente adelante ángulo dispersión ligera¹², donde disminuye la absorbancia refleja inflamación pasiva de la matriz mitocondrial.

Aquí ilustramos la metodología para examinar la mitocondrial Ca^{2 +} capacidad de la retención y Ca^{2 +}-activa hinchazón mitocondrial en las mitocondrias aisladas de células SH-SY5Y.

Protocol

1. aislamiento de mitocondrias Nota: Todas las soluciones y equipos deben preenfriados a 0 – 4 ° C y mantener en hielo. Semillas aproximadamente 3 x 106 SH-SY5Y células por placa de cultivo celular de 10 cm. Células en cultivo en alta glucosa Dulbecco de modificado medio de Eagle con 10% suero fetal bovino, penicilina (100 U/mL)-estreptomicina (100 μg/mL). Mantener a 37 ° C en una incubadora con 5% CO2 durante la noche.Nota: al menos 1-2 x 107 </su…

Representative Results

Representante resultados de capacidad de retención de Ca2 + :Los resultados se expresaron como valores de fluorescencia. Con los pulsos adicionales de Ca2 + (200 nmols/mg proteína mitocondrial), la fluorescencia aumentada por el doble por encima de la línea de fondo con la apertura del mPTP. 5 μM Bongkrekate (BKA), un inhibidor de la Ca2 +-inducida por mPTP apertura o 1 μM atractyloside (ATR), un activador de la Ca2 +-inducida …

Discussion

Aquí, hemos descrito un protocolo sencillo y eficaz para el mitocondrial Ca^{2 +} retención capacidad análisis y Ca^{2 +}-activa ensayo hinchazón mitocondrial.

Para el aislamiento mitocondrial, asegúrese de que todos los materiales y tubos son de hielo, especialmente cuando las células de homogeneización. 0.25% tripsina-EDTA puede utilizarse también para separar las células desde el plato durante 5 minutos a 37 ° C. Después de 15-25 golpes, es necesario observar la m…

Materials

SH-SY5Y cell line	ATCC (The Global Bioresource Center)	ATCC Number: CRL-2266
Calcium green-5N	Life Technologies	c-3737	Ca2+-binding green fluorescent dye
complete protease inhibitors	Roche Molecular Biochemicals	4693116001
glass homogenizer	Kimble Chase	9885303002
glutamate	Sigma-Aldrich	RES5063G-A7
malate	Sigma-Aldrich	46940-U
rotenone	Sigma-Aldrich	R8875
HEPES	Sigma-Aldrich	H3375
MgCl2	Sigma-Aldrich	00457
K2HPO4	Sigma-Aldrich	V900050
KCl	Sigma-Aldrich	P9541
CaCl2	Sigma-Aldrich	V900266
Varioskan flash instruments	Thermo Scientific	IC100E
Bongkrekate	Biovision	1820-100
atractyloside	Sigma-Aldrich	C4992
high-glucose Dulbecco’s modified Eagle medium	Hyclone	SH30022	4.5 g/L glucose, L-glutamine, without sodium pyruvate
fetal bovine serum	Hyclone	SV30087
penicillin	Sigma-Aldrich	P3032
streptomycin	Invitrogen	11860-038
BCA assay kit	Thermo Scientific	NCI3225CH
PBS	Hyclone	SH30256.01
10 cm cell culture dish	NEST	704001