É apresentado um método para análise de espectrometria de massa de peptídeos endógenos em humano líquido cerebrospinal (CSF). Empregando filtração de corte de peso molecular, pre- fracionamento cromatográfico de, análise de espectrometria de massa e uma subsequente combinação de estratégias de identificação do peptide, foi possível expandir o conhecido peptidome CSF quase dez vezes em comparação a estudos anteriores.
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Artigo de método
Preparação da amostra para análise de Endopeptidomic no líquido cefalorraquidiano humano
Neste artigo
Resumo
Resumo
Este protocolo descreve um método desenvolvido para identificar endógenos em humano líquido cerebrospinal (CSF). Para este propósito, um método previamente desenvolvido baseado na filtração de corte (MWCO) de peso molecular e análise de espectrometria de massa foi combinada com uma etapa de pre-fracionamento off-line alta-pH de fase reversa HPLC.
Secreção em CSF é a principal via para a remoção de moléculas derramado pelas células do sistema nervoso central. Assim, muitos processos no sistema nervoso central são refletidos no CSF, tornando-o um fluido de diagnóstico valioso. CSF tem uma composição complexa, contendo proteínas que abrangem uma gama de concentração de 8-9 ordens de magnitude. Além de proteínas, estudos anteriores também têm demonstrado a presença de um grande número de peptídeos endógenos. Enquanto menos extensivamente estudados do que proteínas, estas podem também realizar potencial interesse como biomarcadores.
Peptídeos endógenos foram separados do conteúdo de proteína do CSF através da filtragem MWCO. Removendo a maioria do teor de proteína da amostra, é possível aumentar o volume da amostra estudada e assim também o montante total dos peptides endógenos. A complexidade da mistura do peptide filtrado foi abordada, incluindo uma fase reversa etapa de pre-fracionamento HPLC (RP) em pH alcalino, antes da análise por LC-MS. O fracionamento foi combinado com um esquema simples concatenação onde 60 fracções foram agrupadas em 12, consumo de tempo de análise, assim, poderia ser reduzido, ainda em grande parte, evitando eluição co.
Identificação de peptídeo automatizado foi realizada usando três programas de software de identificação de peptídeos/proteínas diferentes e, posteriormente, combinando os resultados. Os diferentes programas foram complementares, ao invés de comparável com menos de 15% das identificações sobrepostas entre os três.
Introdução
Biomarcadores no líquido cerebrospinal (CSF) atualmente são transformar pesquisa em doenças neurodegenerativas. Na doença de Alzheimer, a doença neurodegenerativa mais comum, afetando mais 60 milhões pessoas em todo o mundo1,2, um trio de biomarcador consistindo o beta amyloid do peptide, estabilizadores do microtubule tau de proteína e um fosforilada forma de tau, pode detectar a doença com alta sensibilidade e especificidade e foi incluída na investigação diagnóstica critérios3. Em outras doenças neurodegenerativas, como a doença de Parkinson e esclerose múltipla, proteomic estudos id....
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Protocolo
O protocolo descrito abaixo é uma versão refinada do que usado no estudo anterior, onde uma grande quantidade de peptídeos endógenos foram identificados em humanos CSF15. Atualizações para o protocolo original envolvem alterações menores para o pré-tratamento químico de LCR, bem como a optimização do gradiente usada para off-line pre-fraccionamento RP HPLC de alta-pH.
Considerações éticas
Todos os estudos de materiais sueco do paciente e controle foram aprovados pelos comitês de éticas: Göran St (Ref. 2005-554-31/3). CSF samples a coorte de demência de Amesterdão e amostra....
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Resultados
O método descrito aqui foi aplicado e avaliado em três estudos antes da introdução de pre-fracionamento de amostra (tabela 1). O primeiro estudo usado LC off-line para detectar frações CSF em uma placa-alvo MALDI e resultou em 730 endógenos identificados11. Em dois estudos seguintes, rotulagem isobárica foi empregado. Principalmente em um caso/controle estudo para identificação e caracterização de potenciais biomarcadores no CSF endopeptidome e proteome simultaneamente24e n.......
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Discussão
A introdução de uma etapa de pre-fracionamento RP HPLC alta-pH para um protocolo previamente desenvolvido para recuperação de peptídeos endógenos por peso molecular ultrafiltração11 amostra relativa complexidade reduzida e, assim, permitido para um 5-fold maior volume de amostra a ser estudada. Este, por sua vez, aumentou a concentração do subconjunto de peptídeos presentes em cada fração e melhorado, assim, as chances de detectar baixos peptídeos abundantes.
Através da.......
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Divulgações
Sem interesses concorrentes, financeiros ou outros, entre os autores têm sido relatados.
Agradecimentos
Muito obrigado a Tanveer Batth e colegas para o Conselho em Configurando o método de pre fracionamento.
Este trabalho foi apoiado pelo financiamento do Conselho Sueco de pesquisa, a Margot Wallström e Sjöblom Foundation, a arma e Bertil Stohne Fundação Stiftelse, Fundação Bergwall Magnus, Åhlén Foundation, Alzheimerfonden, Demensförbundet, Stiftelsen för Gamla Tjänarinnor, o Knut e Alice Wallenberg Foundation, Frimurarestiftelsen e FoU-Västra Götalandsregionen.
Os principais beneficiários do financiamento para este projeto foram Kaj Blennow, Henrik Zetterberg e Johan Gobom.
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| 1 M Triethylammonium bicarbonato | Fluka, Sigma-Aldrich | 17902-100ML | TEAB& |
| nbsp; 8 M Cloridrato de guanidínio | Sigma-Aldrich | G7294-100ML | GdnHCl |
| Tris (2-carboxietil) cloridrato de fosfina | Pierce | 20490 | TCEP |
| Iodoacetamida | SIGMA | I1149-5G | IAA |
| Hidroxilamina 50% (p / p) | Sigma-Aldrich | 457804-50ML | |
| Acetonitrila, Far UV, grau de gradiente HPLC | Sigma-Aldrich | 271004-2L | AcN |
| Ácido fórmico | Fluka, Sigma-Aldrich | 56302-1mL-F | FA |
| Ácido triflouroacético | Sigma-Aldrich | T6508-10AMP | TFA |
| Solução de hidróxido de amônio | Sigma-Aldrich | 30501-1L-1M | NH4OH |
| Unidade de Filtro Centrífugo Amicon Ultra-15 com membrana Ultracel-30 | Filtro Merck Millipore | UFC903024 | |
| MWCO Sep-Pak C18, 100 mg | Coletor SPE de | 12 | |
| portas Waters WAT023590 SPE-column Resprep | Restek | 26077 | Coletor de vácuo |
| TMT10plex Conjunto de reagentes de etiqueta isobárica | Thermo Fisher Scientific | 90110 | TMT10plex |
| UltiMate 3000 RSLCnano LC System | Dionex | 5200.0356 | Separação de amostras on-line |
| Ultimate 3000 RPLC Sistema binário de separação rápida | Dionex | IQLAAAGABHFAPBMBEZ | Fracionamento offline de alto pH |
| Orbitrap Fusion Tribrid espectrômetro de massa | Thermo Scientific | IQLAAEGAAPFADBMBCX | Espectrômetro de massa para análise de amostras |
| Proteome Discoverer 2.0 | Thermo Fisher Scientific | IQLAAEGABSFAKJMAUH | Plataforma de pesquisa de proteômica |
| Mascot v2.4 | Matrix Science | - | Motor de busca de proteómica |
| Sequest HT | Thermo | - | Motor de busca de proteómica |
| PICOS v7.5 | Soluções de Bioinformática Inc.) | - | Motor de busca de proteómica |
| Acclaim PepMap 100, 75 µ m x 2 cm, C18, 100 Å tamanho do poro, 3 µ m tamanho de partícula | Thermo Fisher Scientific | 164535 | Trap column (nano HPLC) |
| Acclaim PepMap C18, 75 µ m x 500 mm, 100Å tamanho dos poros, 2 µ m tamanho de partícula | Thermo Fisher Scientific | 164942 | Coluna de Separação (nano HPLC) |
| Concentradores de Alta Capacidade Savant SpeedVac | Thermo Fisher Scientific | SC210A-230 | SpeedVac / Concentrador de vácuo |
| XBridge Peptídeo BEH C18 Coluna, 130Å, 3.5 µ m, 2,1 mm X 250 mm | de Separação de 186003566 | de Água | (micro HPLC) |
Referências
- Wimo, A., et al. The worldwide costs of dementia 2015 and comparisons with 2010. Alzheimers Dement. 13 (1), 1-7 (2017).
- Scheltens, P., et al. Alzheimer's disease. Lancet. 388 (10043), 505-517 (2016).
- Dubois, B., et al.
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Reimpressões e permissões
