Vurdering af urinvejene Junction obstruktion defekter ved methylenblåt farvning injektion
Summary
Methylenblåt farvning af injektion i nyrebækkenet letter vurdering af urinvejene junction obstruktion defekter under musen embryonale urinveje udvikling. Her, er en protokol for methylenblåt farvning af injektion i nyrebækkenet beskrevet.
Abstract
Urinveje junction obstruktion defekter er medfødte misdannelser inducerende hydronefrose og hydroureter. Murine urinveje junction obstruktion defekter kan vurderes ved at spore methylenblåt farvning af flow i urinvejene. Methylenblåt farvestof indsprøjtes i nyrebækkenet af perinatal embryonale nyrer og farvestof flow overvåges fra nyrebækken af nyren gennem ureter og blære lumen efter anvende hydrostatiske pres. Dye ophobning vil fremgå i blæren lumen af normale perinatal urinvejene, men vil blive begrænset mellem nyrebækkenet og slutpunktet for en unormal ureter, hvis urinveje hindringer opstår. Denne metode fremmer bekræftelse af urinvejene junction forhindringer og visualisering af hydronefrose og hydroureter. Dette manuskript beskriver en protokol for methylenblåt farvning injektion i nyrebækken at bekræfte urinveje junction forhindringer.
Introduction
Urinvejene består af et par af nyrerne og urinlederne og en fælles blæren og urinrøret. Den vigtigste funktion af urinvejene er at opretholde kroppens homeostase ved at styre vand og elektrolyt balancen i blodet. Nyrerne filtrerer blodet til kontrol elektrolytten koncentrationer og syre-base balance og producere urin for at udskille overskydende vand og affald herunder opløste stoffer og metabolitter. Urin er derefter transporteres gennem ureter fra nyrebækken i nyrerne til at bladderin en ensrettet måde, hvor det er gemt og i sidste ende fjernes via urinrøret1.
Urinlederne er lige rør med oprindelse fra den nephric duct. Efter spirende fra nephric kanalen på embryonale dag 10.5 (E10.5) i musen, ureter stilk elongates og adskiller i et flerlaget struktur kaldet urothelium, som er uigennemtrængeligt mellem mus, E12.5 og E16.5. Mesenchymale celler omkring ureter stilk er også opdeles i tre lag bestående af indre stromale celler, mellemliggende tyk glatte muskelceller og ydre adventitial fibroblaster. Ureter peristaltiske bølger indlede i nyrebækkenet er opformeret gennem glat muskel lag af ureter væggen til blæren til at transportere urin2,3, som er produceret, startende fra E16.5 i musen1.
Medfødte misdannelser af nyre og urinveje (CAKUT) er blandt de hyppigste genetiske sygdomme, til stede i omkring 1% af menneskelige fostre1,4, og består af en række forskellige fænotyper herunder hydronefrose og hydroureter. Unormal ophobning af urin i nyre og ureter resulterer i hydronephrotic nyre og hydroureter dannelse. En årsag til hydronefrose og/eller hydroureter dannelse er en obstruktion af urinvejene. Ureteropelvic junction obstruktion (UPJO) er forårsaget af afvigende urin flow på grund af en blokering mellem de proksimale urinleder og nyrebækken, hvilket resulterer i hydronefrose og proksimale hydroureter indsnævring med vinkling eller vedvarende folde5, 6. Derudover kaldes det ektopiske indsættelse af den distale ureter i enten blærevæggen eller forplantningsorganerne ureterovesical junction obstruktion (UVJO). UVJO kan også medføre hydronefrose og hydromegaureter dannelse7,8. En yderligere ureterovesical krydset (UVJ) defekt er vesicoureteric refluks (VUR). VUR er karakteriseret ved retrograde urin flow fra blæren mod nyre på UVJ. I forhold til UVJO, viser perinatal embryoner med VUR tydeligt ikke en udspilet hydronephrotic nyre eller svær hydroureter fænotype9.
I laboratoriet mus, kan urin flow undersøges ved injektion af et farvestof, såsom methylene blå, i nyrebækkenet9. Injectedmethylene blå løsning vil spore urin bane fra nyrebækken gennem ureter og ind i blæren. Hydronefrose kan genkendes af en udvidelse af farvestof i nyrerne. UPJO kan blive opdaget som en blokering af farvestof flow på den proksimale ureter med udspilede nyrebækken5. Enhver dilatation af ureter angivet med en udvidet diameter viser et eksempel på hydroureter. Endelig, farvestof ophobning på blærevæggen eller på stedet af forplantningsorganerne angiver UVJO med udspilede hydronephrotic nyre og forstørrede hydromegaureter7,10. For at påvise VUR, farvestof løsning er sprøjtet ind i blæren og efterfølgende retrograd flow overvåges i nyre9.
Her, er en protokol for methylenblåt farvning af injektion i nyrebækkenet af en perinatal embryo præsenteret. Denne protokol giver mulighed for sporing af urin flow fra nyrebækken gennem ureter og ind i blæren og kontrollerer potentielle urinveje junction forhindringer som UPJO eller UVJO.
Protocol
Representative Results
Discussion
Musen nyrer er funktionelle begyndelsen på E16.5 og en farve injektion test er teoretisk muligt fra dette tidspunkt. Men nyren er for små til at blive injiceret med farvestof løsning og fænotyper som hydronefrose og hydroureter overholdes ikke klart da disse fænotyper er en sekundær effekt af urin bygget på grund af unormale urin transport. Disse fænotyper, fra forhindringer som UPJO eller UVJO, er indlysende på E18.5 af udspilet nyrerne og urinlederne. Større nyrerne af embryoner på E19.5 eller neonatal unger…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Jeg takker Dr. Alan O. Perantoni (CDBL/NCI/NIH) til støtte for forelæggelsen af dette manuskript. Jeg takker også Dr. Michael Hall (CDBL/NCI/NIH) og Nirmala Sharma (CDBL/NCI/NIH) til at redigere dette håndskrift. Jeg er taknemmelig til Lai Thang (SAIC) for hans fremragende mus dyrehold. Dette arbejde blev støttet af de nationale kontorer i sundhed, National Cancer Institute og Center for kræftforskning.
Materials
| Methylene blue | Sigma-Aldrich | M9140 | |
| Quality Biological Inc. NORMAL SALINE – 500ML | Fisherscientific | 50-983-204 | |
| 3 mL disposable syringe with BD Luer-Lok tip | BD | 309657 | |
| Acrodisc Syringe Filters with Supor Membrane | Pall corporation | 4614 | |
| Exel Scalp Vein (Butterfly) Sets; 27G x 3/4" 12" | EXELINT | 26709 | |
| Delicate Operating Scissors | Roboz Surgical Instrument Co. | RS-6702 | |
| Micro Dissecting Forceps | Roboz Surgical Instrument Co. | RS-5135 | |
| Dumont Tweezers; Pattern #5 | Roboz Surgical Instrument Co. | RS-5045 | |
| BD PrecisionGlide Needles 30 G x 1/2" | BD | 305106 |
Referências
- Rasouly, H. M., Lu, W. Lower urinary tract development and disease. Wiley Interdiscip Rev Syst Biol Med. 5, 307-342 (2013).
- Kispert, A. T-Box Genes in the Kidney and Urinary Tract. Curr Top Dev Biol. 122, 245-278 (2017).
- Bohnenpoll, T., Kispert, A. Ureter growth and differentiation. Semin Cell Dev Biol. 36, 21-30 (2014).
- Nicolaou, N., Renkema, K. Y., Bongers, E. M., Giles, R. H., Knoers, N. V. Genetic, environmental, and epigenetic factors involved in CAKUT. Nat Rev Nephrol. 11, 720-731 (2015).
- Tripathi, P., Wang, Y., Casey, A. M., Chen, F. Absence of canonical Smad signaling in ureteral and bladder mesenchyme causes ureteropelvic junction obstruction. J Am Soc Nephrol. 23, 618-628 (2012).
- Aoki, Y., et al. Id2 haploinsufficiency in mice leads to congenital hydronephrosis resembling that in humans. Genes Cells. 9, 1287-1296 (2004).
- Yun, K., Perantoni, A. O. Hydronephrosis in the Wnt5a-ablated kidney is caused by an abnormal ureter-bladder connection. Differentiation. 94, 1-7 (2017).
- Uetani, N., Bouchard, M. Plumbing in the embryo: developmental defects of the urinary tracts. Clin Genet. 75, 307-317 (2009).
- Murawski, I. J., Watt, C. L., Gupta, I. R. Assessing urinary tract defects in mice: methods to detect the presence of vesicoureteric reflux and urinary tract obstruction. Methods Mol Biol. 886, 351-362 (2012).
- Weiss, A. C., et al. Nephric duct insertion requires EphA4/EphA7 signaling from the pericloacal mesenchyme. Development. 141, 3420-3430 (2014).
