Live-imaging van borst epitheliale cel migratie na de voorbijgaande uitputting van TIP60
Summary
Hier presenteren we de real-time bewaking van de cel migratie in een wondgenezing assay met behulp van TIP60-verarmd MCF10A borst epitheliale cellen. De uitvoering van live-cel beeldvormingstechnieken in ons protocol kan we analyseren en visualiseren van eencellige verkeer in real time en in de tijd.
Abstract
De wondgenezing bepaling is efficiënt en één van de voordeligste manieren om de cel migratie in vitrostudie. Conventioneel, images zijn geschoten aan het begin en einde van een experiment met behulp van een Microscoop fase contrast, en de capaciteiten van de migratie van de cellen worden geëvalueerd door de sluiting van wonden. Cel verkeer is een dynamisch verschijnsel echter, en een conventionele methode voor het bijhouden van eencellige verkeer niet mogelijk. We gebruik om te verbeteren huidige wondgenezing testen, live-cel beeldvormingstechnieken cel migratie in real-time volgen. Deze methode laat ons toe om het bepalen van de cel migratie percentage op basis van een cel tracking systeem en biedt een duidelijker onderscheid tussen cel migratie en celproliferatie. Wij tonen hier, het gebruik van live-cel beeldvorming in de wond-genezing testen te bestuderen van de capaciteiten van de verschillende migratie van borst epitheliale cellen beïnvloed door de aanwezigheid van TIP60. Als cel beweeglijkheid zeer dynamisch is, biedt onze methode meer inzicht in de processen van wond genezing dan een momentopname van de wond sluiting genomen met de traditionele beeldvormingstechnieken gebruikt voor wondgenezing testen.
Introduction
HIV-Tat-interactieve eiwit 60 kDa (TIP60) is een lysine-acetyltransferase die zowel histone en niet-Histon eiwitten1,2 acetylate kan. De functies worden gevonden gevolgen kunnen hebben in meerdere signaalroutes, met inbegrip van transcriptie, DNA-schade reparatie en apoptosis1,3,4,5,6, 7 , 8. Bovendien TIP60 is vaak werden in kanker, en haar Downregulatie is gecorreleerd met kanker uitzaaiingen en arme survival tarieven9,10,11,12, 13,14. Uitzaaiing van de tumor is de belangrijkste oorzaak van sterfgevallen ten gevolge van kanker. Het is een proces van meerdere stappen, en de eerste stap van metastase impliceert de migratie en invasie van tumorcellen in aangrenzende weefsels15,16. Om dit te doen, tumorcellen eerst moeten loskoppelen van de primaire tumor massa, hetzij in de vorm van een collectief binnenvallende cellaag of vrijstaand als afzonderlijke cellen17. Tijdens dit proces ondergaan vaak tumorcellen epitheliale mesenchymale overgang (EMT), wat resulteert in veranderingen in de morfologie en cel adhesie vermogen17,18.
Een paar technieken zijn ontwikkeld om te bestuderen van de migratie en invasie vermogen van tumor cellen in vitro. Onder hen is de wondgenezing bepaling de meest efficiënte en voordelige19. Deze methode houdt ten eerste de oprichting van een kunstmatige kloof op een confluente enkelgelaagde van cellen, waardoor de cellen om te migreren en de kloof dichten. Ten tweede, kunnen beelden van de lacunes worden vastgelegd aan het begin en einde van het experiment. Tot slot wordt een vergelijking van kloof sluiting gebruikt voor het bepalen van de omvang van de migratie van de cel. Een fase contrast Microscoop wordt meestal gebruikt om beelden voor conventionele wondgenezing testen te vangen. Een ander voordeel van de wondgenezing bepaling is dat deels in vivo tumor cel migratie lijkt. Ook toont in vivo de uitzaaiing van de tumor, cel migratie in de wond-genezing assays zowel de collectieve migratie van epitheliale bladen en de migratie van vrijstaande afzonderlijke cellen.
Echter cel migratie is bekend om zijn dynamische, en er is een noodzaak voor het documenteren van het verkeer van cellen in real-time. Een conventionele wondgenezing assay staat bijvoorbeeld geen een onderzoeker voor het analyseren van eencellige beweging. Aan de andere kant, zijn cellen gekweekt voor wondgenezing testen vaak serum-uitgehongerd voor de remming van celproliferatie. Dit wordt gedaan om het uitsluiten van de mogelijkheid van kloof sluiting als gevolg van celproliferatie. Toch zullen er nog sommige proliferatie en celdood, en fase-contrast beelden genomen vóór en na het experiment niet in staat om onderscheid tussen hen te zijn.
De live-cel beeldvormende techniek richt deze beperking van conventionele wondgenezing tests. Met behulp van een Microscoop wonen-imaging in combinatie met een CO2 incubator en passende temperatuurregeling, onderzoekers de kloof grootte kunnen meten en het percentage van de sluiting na verloop van tijd terwijl tracering van het verkeer van actief migreren cellen gelegen op de toppen van de invasieve voorkant. Vandaar, de uitvoering van live-cel imaging als u wilt controleren cel migratie zal niet alleen het leveren van betere visualisatie van cel migratie, maar zal ook voorzien in de mogelijkheid om te differentiëren tussen cel migratie en celproliferatie, waardoor een meer betrouwbare analyse van cel migratie.
In deze studie werden MCF10A borst epitheliale cellen gebruikt om aan te tonen van de combinatie van de wond-genezing assay en live-cel imaging om te bestuderen van de rol van TIP60 in cel migratie. De uitputting van de TIP60 resulteert in verhoogde migratie capaciteiten in MCF10A cellen.
Protocol
Representative Results
Discussion
Het is bekend dat in het proces van migratie van de cel, cellen ofwel beweging in de vorm van aanhangend vellen kunnen; losse clusters; of enkele, geïsoleerde cellen. De modus en de dynamiek van de invasie van de cel kunnen variëren van één voorwaarde naar de andere en het fenotype binnen uur kunt wijzigen. De traditionele wondgenezing bepaling is gebaseerd op opnames van de momentopname van een microscoop met een lange tijdsinterval, bijvoorbeeld 12 of 24 h. Dit maakt het moeilijk om de dynamiek van de sluiting van …
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wij danken de leden van het JBZ-laboratorium voor hun nuttige discussie en commentaar. S.J. werd gesteund door subsidies van de National Research Foundation Singapore en het Singapore ministerie van onderwijs onder de onderzoekscentra van Excellence initiatief naar de kanker Science Institute van Singapore (R-713-006-014-271), de nationale medische Onderzoeksraad (CBRG-NIG; BNIG11nov001 en CS-IRG; R-713-000-162-511), het ministerie van onderwijs academische onderzoeksfonds (MOE AcRF Tier 1 T1-2012 okt-04). Y.Z., G.S.C. en C.Y.T. werden ondersteund door een postdoctorale fellowship uitgereikt door de kanker Science Institute van Singapore, National University of Singapore.
Materials
| MCF10A cell | ATCC | CRL-10317TM | Breast epithelial cell |
| DMEM/F12 media (1:1) | Gibco | 11330-032 | MCF10A culture media |
| Epithelial growth factor (EGF) | Peprotech | AF-100-15 | Supplements for MCF10A culture media |
| Cholera Toxin | Sigma-Aldrich | C-8052 | Supplements for MCF10A culture media |
| Hydrocortisone | Sigma-Aldrich | H-0888 | Supplements for MCF10A culture media |
| Insulin | Sigma-Aldrich | I-1882 | Supplements for MCF10A culture media |
| House serum | Gibco | 16050-122 | Supplements for MCF10A culture media |
| Trypsin | Gibco | 25200-056 | For MCF10A detach from plate |
| Hemacytometer | Fisher Scientific | 267110 | For counting cell |
| Opti-MEM reduced serum media | Gibco | 31985-070 | For siRNA mixture |
| Lipofectamine RNAiMAX | Invitrogen/Life Technologies | 56532 | Transfect reagent |
| Trizol reagent | Invitrogen/Life Technologies | 15596-026 | For mRNA extraction |
| iScript cDNA Synthesis Kit | Bio-Rad | 170-8891 | For cDNA generation |
| iTaq Universal SYBR Green Supermix | Bio-Rad | 172-5125 | For real time qPCR |
| 7500 Fast Real Time PCR system | Biosystems | Real time qPCR mechine | |
| 10-cm dish | Greiner bio-one | 664160 | For Knockdown experiment |
| 24-well plate | Cellstar | 662160 | For wound healing assay |
| siControl siRNA | Self designed | Self designed | CGUACGCGGAAUACUUCGAdTdT |
| siTIP60 siRNA | Self designed | Self designed | UGAUCGAGUUCAGCUAUGAdTdT |
| Live cell observer | Zeiss | Zeiss inverted Cell Observer for live cell experiments |
Referências
- Sun, Y., Jiang, X., Chen, S., Fernandes, N., Price, B. D. A role for the Tip60 histone acetyltransferase in the acetylation and activation of ATM. Proc Natl Acad Sci U S A. 102 (37), 13182-13187 (2005).
- Sykes, S. M., Stanek, T. J., Frank, A., Murphy, M. E., McMahon, S. B. Acetylation of the DNA binding domain regulates transcription-independent apoptosis by p53. J Biol Chem. 284 (30), 20197-20205 (2009).
- Jha, S., Shibata, E., Dutta, A. Human Rvb1/Tip49 is required for the histone acetyltransferase activity of Tip60/NuA4 and for the downregulation of phosphorylation on H2AX after DNA damage. Mol Cell Biol. 28 (8), 2690-2700 (2008).
- Sapountzi, V., Logan, I. R., Robson, C. N. Cellular functions of TIP60. Int J Biochem Cell Biol. 38 (9), 1496-1509 (2006).
- Squatrito, M., Gorrini, C., Amati, B. Tip60 in DNA damage response and growth control: many tricks in one HAT. Trends Cell Biol. 16 (9), 433-442 (2006).
- Sun, Y., Xu, Y., Roy, K., Price, B. D. DNA damage-induced acetylation of lysine 3016 of ATM activates ATM kinase activity. Mol Cell Biol. 27 (24), 8502-8509 (2007).
- Sykes, S. M., et al. Acetylation of the p53 DNA-binding domain regulates apoptosis induction. Mol Cell. 24 (6), 841-851 (2006).
- Tang, Y., Luo, J., Zhang, W., Gu, W. Tip60-dependent acetylation of p53 modulates the decision between cell-cycle arrest and apoptosis. Mol Cell. 24 (6), 827-839 (2006).
- Chen, G., Cheng, Y., Tang, Y., Martinka, M., Li, G. Role of Tip60 in human melanoma cell migration, metastasis, and patient survival. J Invest Dermatol. 132 (11), 2632-2641 (2012).
- Gorrini, C., et al. Tip60 is a haplo-insufficient tumour suppressor required for an oncogene-induced DNA damage response. Nature. 448 (7157), 1063-1067 (2007).
- Jha, S., et al. Destabilization of TIP60 by human papillomavirus E6 results in attenuation of TIP60-dependent transcriptional regulation and apoptotic pathway. Mol Cell. 38 (5), 700-711 (2010).
- Kim, J. H., et al. Transcriptional regulation of a metastasis suppressor gene by Tip60 and beta-catenin complexes. Nature. 434 (7035), 921-926 (2005).
- Sakuraba, K., et al. Down-regulation of Tip60 gene as a potential marker for the malignancy of colorectal cancer. Anticancer Res. 29 (10), 3953-3955 (2009).
- Subbaiah, V. K., et al. E3 ligase EDD1/UBR5 is utilized by the HPV E6 oncogene to destabilize tumor suppressor TIP60. Oncogene. , (2015).
- Friedl, P., Wolf, K. Tumour-cell invasion and migration: diversity and escape mechanisms. Nat Rev Cancer. 3 (5), 362-374 (2003).
- Nguyen, D. X., Bos, P. D., Massague, J. Metastasis: from dissemination to organ-specific colonization. Nat Rev Cancer. 9 (4), 274-284 (2009).
- Zijl, F., Krupitza, G., Mikulits, W. Initial steps of metastasis: cell invasion and endothelial transmigration. Mutat Res. 728 (1-2), 23-34 (2011).
- Lamouille, S., Xu, J., Derynck, R. Molecular mechanisms of epithelial-mesenchymal transition. Nat Rev Mol Cell Biol. 15 (3), 178-196 (2014).
- Liang, C. C., Park, A. Y., Guan, J. L. In vitro scratch assay: a convenient and inexpensive method for analysis of cell migration in vitro. Nat Protoc. 2 (2), 329-333 (2007).
- Zhang, Y., et al. TIP60 inhibits metastasis by ablating DNMT1-SNAIL2-driven epithelial-mesenchymal transition program. J Mol Cell Biol. , (2016).
- Riahi, R., Yang, Y., Zhang, D. D., Wong, P. K. Advances in wound-healing assays for probing collective cell migration. J Lab Autom. 17 (1), 59-65 (2012).
- Jonkman, J. E., et al. An introduction to the wound healing assay using live-cell microscopy. Cell Adh Migr. 8 (5), 440-451 (2014).
