O peixe-zebra é um popular modelo animal para estudar os mecanismos da degeneração/regeneração da retina em vertebrados. Este protocolo descreve um método para induzir lesões localizadas perturbar a retina exterior com danos mínimos à retina interna. Posteriormente, acompanhamos na vivo a morfologia da retina e a resposta de glia Müller em toda a regeneração da retina.
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Artigo de método
Ativação de células da Müller Glia em um modelo de regeneração no Zebrafish e degeneração retiniana induzida por Laser
Neste artigo
Resumo
Resumo
Uma fascinante diferença entre teleósteos e mamíferos é o potencial ao longo da vida da retina teleósteos para retina neurogênese e regeneração após danos graves. Investigar os caminhos de regeneração no zebrafish pode trazer novas perspectivas para desenvolver estratégias inovadoras para o tratamento de doenças degenerativas da retina em mamíferos. Neste documento, enfocamos a indução de uma lesão focal da retina exterior no zebrafish adulto por meio de um laser de díodo 532 nm. Uma lesão localizada permite investigar os processos biológicos que ocorrem durante a degeneração da retina e regeneração diretamente na área de danos. Usando a tomografia de coerência óptica não-invasiva (OCT), fomos capazes de definir a localização da regeneração subsequente danificada área e monitor in vivo. Com efeito, imagens OCT produz imagens de alta resolução, transversais da retina zebrafish, fornecendo informações que anteriormente só existiam disponíveis com análise histológica. A fim de confirmar os dados de outubro em tempo real, realizaram-se cortes histológicos e resposta regenerativa após a indução da lesão da retina foi investigada por imuno-histoquímica.
Introdução
Visão é, provavelmente, o sentido mais essencial do ser humano e sua deficiência tem um alto impacto sócio-económico. No mundo industrializado, doenças degenerativas da retina representam a maioria da perda de visão e cegueira entre a população adulta de1. Retinite pigmentosa (RP) é a causa herdada mais comum de cegueira em pessoas entre as idades de 20 e 60, afetando aproximadamente 1,5 milhões de pessoas em todo o mundo2,3. É uma família heterogénea de desordens hereditárias da retina, caracterizada por perda progressiva dos FOTORRECEPTORES (PRs) seguido de degeneração do epitélio pig....
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Protocolo
todos os experimentos aderiu à instrução para o uso de animais em oftalmologia e visão pesquisas da Associação para pesquisa em visão e oftalmologia (ARVO) e respeitar os regulamentos relacionados das autoridades governamentais.
1. animais
- TgBAC manter (gfap:gfap-GFP) zebrafish 167 estirpe de (AB) com idade entre 6-9 meses em condições normais na água com uma temperatura de 26,5 ° C e um ciclo claro/escuro de 14/10 h 18.
- Seguir as orientações de cuidados com animais das instituições envolvidas para as experiências em animais após aprovação pelas autoridades governamentais.
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Resultados
OCT em tempo real: a fim de analisar o papel dos MCs na reparação da retina, usamos um modelo de lesão laser induzindo uma zona bem delineada de danos na retina zebrafish. O site do dano foi fotografado por meio da OCT na vivo pela primeira vez (dia 0) dentro de 60 minutos após a lesão (Figura 3). Para compensar o sistema ótico do olho de peixe, uma lente de contato feito por foi colocada sobre a córnea. Imediatamente após o tratamen.......
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Discussão
Regeneração/degeneração da retina no zebrafish foi investigada por abordagens diferentes, como de morte celular mediada por cytotoxin22, lesão mecânica23e lesões térmicas24. Utilizamos um laser de díodo 532 nm para danificar a retina do zebrafish. Desse modo, nosso modelo oferece várias vantagens. Por exemplo, rapidamente criamos uma área bem definida de lesões localizadas na retina exterior, especificamente na camada de fotorreceptores. Além disso, .......
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Divulgações
Os autores não têm nada para divulgar.
Agradecimentos
Agradecemos Martin Zinkernagel, MD, PhD e Miriam Reisenhofer, PhD pela sua entrada de científica no que estabelece o modelo e Federica Bisignani pela sua excelente assistência técnica.
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Solução de hematoxilina ácida | Sigma-Aldrich, Buchs, Suíça | 2852 | |
| Albumina | Sigma-Aldrich, Buchs, Suíça | A07030 | |
| Albumina de soro bovino (BSA) | Sigma-Aldrich, Buchs, Suíça | 5470 | |
| Dako Pen | Dako, Glostrup, Danmark | S2002 | |
| Meio de montagem DAPI | Vector Labs, Burlingame, CA, EUA | H-1200 | |
| Eosin G solução aquosa 0,5% | Carl Roth, Arlesheim, Suíça | X883.2 | |
| Etanol | Sigma-Aldrich, Buchs, Suíça | 2860 | |
| Ácido etilenodiamina tetracético (EDTA) | Sigma-Aldrich, Buchs, Suíça | ED | |
| Eukitt | Sigma-Aldrich, Buchs, Suíça | 3989 | |
| IgG anti-coelho para cabras H& L Alexa Fluor® 488 | Life Technologies, Zug, Suíça | A11008 | |
| IgG anti-rato de cabra H& L Alexa Fluor® 594 | Life Technologies, Zug, Suíça | A11020 | |
| Soro normal de cabra | Dako, Glostrup, Danmark | X0907 | |
| Lente de contato de hidrogel | Johnson & Johnson AG, Zug, Suíça | n.a.1-Day | Acuvue Moist |
| Hydroxypropylmethylcellulose 2% | OmniVision, Neuhausen, Switzerland | n.a.Methocel | 2% |
| Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate | Sigma-Aldrich, Buchs, Switzerland | Tricaine-A5040 | , MS-222 |
| Visulas 532s | Carl Zeiss Meditec AG, Oberkochen, Alemanha | n.a.532 | nm laser |
| Mouse anticorpo monoclonal anti-GS | Millipore, Billerica, MA, USA | MAB302 | |
| HRA + OCT Imaging System | Heidelberg Engineering, Heidelberg, Alemanha | n.a.Spectralis | |
| Heidelberg Eye Explorer | Heidelberg Engineering, Heidelberg, Alemanha | n.a.Version | 1.9.10.0 |
| Paraformaldeído (PFA) | Sigma-Aldrich, Buchs, Suíça | P5368 | |
| Solução salina tamponada com fosfato (PBS) | Sigma-Aldrich, Buchs, Suíça | P5368 | |
| Anticorpo policlonal anti-GFAP para coelhos | Invitrogen, Waltham, MA, EUA | 180063 | |
| Suporte de pino de silicone | Huco Vision AG Suíça | n.a.Corte | à mão a partir do tapete de silicone da bandeja de esterilização em conformidade. |
| Lâmpada de fenda BM900 | Haag-Streit AG, Koeniz, Suíça | n.a.Adaptador | |
| lâmpada de fenda | Iridex Corp., Mountain View, CA, EUA | n.a.Superfrost | |
| Plus lâminas de vidro | Gehard Menzel GmbH, Braunschweig, Alemanha | 10149870 | |
| TgBAC (gfap:gfap-GFP) zf167 (AB) strain | KIT, Karlsruhe, Alemanha | 15204 | http://zfin.org/ZDB-ALT-100308-3 |
| Tris tamponado com solução salina (TBS) | Sigma-Aldrich, Buchs, Suíça | P5912 | |
| Tween 20 | Sigma-Aldrich, Buchs, Suíça | P1379 | |
| 78D lente de lâmpada de fenda sem contato | Volk Optical, Mentor, OH, EUA | V78C | |
| Xileno | Sigma-Aldrich, Buchs, Suíça | 534056 | |
| Lente laser de fundo de olho | Ocular Ocular Instruments, Bellevue, WA, USA | OFA2-0 | |
| 2100 Retriever | Aptum Biologics Ltd., Southampton, Reino Unido | R2100-EU | Steamer |
Referências
- Haddad, S., Chen, C. A., Santangelo, S. L., Seddon, J. M. The genetics of age-related macular degeneration: a review of progress to date. Surv. Ophthalmol. 51 (4), 316-363 (2006).
- Stefano Ferrari, S., Di Iorio, E., Barbaro, V., Ponzin, D., Sorrentino, F. S., Parmeggiani, F. Retin....
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Reimpressões e permissões
