Müller Glia celle aktivering i en Laser-indusert Retinal degenerasjon og Regeneration modell i sebrafisk
Summary
Sebrafisk er en populær dyr modell å studere mekanismer for retinal degenerasjon/gjenfødelse virveldyr. Denne protokollen beskriver en metode for å indusere lokaliserte skade forstyrre ytre netthinnen med minimal skade indre netthinnen. Senere, overvåker vi i vivo retinal morfologi og Müller glia respons gjennom netthinnens gjenfødelse.
Abstract
Fascinerende forskjell teleoster og pattedyr er livslang potensialet av teleost netthinnen for retinal neurogenesis og etter alvorlig skade. Undersøker gjenfødelse stier i sebrafisk kunne bringe ny innsikt å utvikle innovative strategier for behandling av netthinnens degenerative sykdommer i pattedyr. Her, fokuserte vi på induksjon av en fokal leksjonen på ytre netthinnen i voksen sebrafisk ved hjelp av en 532 nm diode laser. En lokalisert skade kan undersøke biologiske prosesser som finner sted under retinal degenerasjon og regeneration direkte på området skade. Bruker ikke-invasiv optical coherence tomografi (OCT), kunne vi definerer plasseringen av skadet område og skjerm påfølgende gjenfødelse i vivo. Faktisk produserer OCT bildebehandling med høy oppløsning, tverrsnittsstudie bilder av sebrafisk netthinnen, som gir informasjon som var tidligere bare tilgjengelig med histologiske analyser. For å bekrefte dataene fra sanntid OCT, histologiske delene ble utført og regenererende svar etter induksjon av netthinnen skaden ble undersøkt av immunhistokjemi.
Introduction
Visjonen er trolig den viktigste følelsen av mennesket og dens verdifall har samfunnsøkonomiske inntrykk. I den industrialiserte verden utgjør netthinnens degenerative sykdommer flertallet av synstap og blindhet blant voksne1. Retinitis pigmentosa (RP) er den vanligste arvet årsaken til blindhet i folk mellom 20 og 60, påvirker ca 1,5 millioner mennesker verden over2,3. Det er en heterogen arvet retinal lidelser preget av progressiv tap av fotoreseptorer (PRs) etterfulgt av degenerasjon av netthinnens pigment epitel og, senere, gliosis og ombygging av indre neurons4. I løpet av sykdommen kan forklares av inkrementell tap av de to PR celletyper, vanligvis igangsetting med stenger, som er ansvarlig for akromatisk visjon i svakt lys og kjegler, som er essensielle for farge visjon og synsskarphet5. Ett gen feil er tilstrekkelig til å forårsake RP. Hittil er mer enn 130 mutasjoner i over 45 gener forbundet med sykdom6. Dette fører til varierende sykdom fenotyper er en grunn til at genterapi er ikke-generalizable og dermed intrikate terapeutisk tilnærming. Derfor er det et presserende behov for å utvikle nye generelle terapeutiske metoder å behandle netthinnens degenerations i blendende sykdommer.
Retinal degenerasjon ofte innebærer PR tap; Derfor er PR celledød et kjennetegn på utarte prosesser i netthinnen7. Det har allerede vist at PR celledød stimulerer Müller glia celle (MC) aktivisering og spredning8. MCs, hvilken stor glial celle i virveldyr netthinnen, en gang ble ansett å være noe mer enn en “limet” mellom retinal neurons. De siste årene, har mange studier vist at MCs handle mer enn bare strukturell støtte9. Blant de forskjellige funksjonene, MCs deltar også i neurogenesis og reparere10. Faktisk svar diffusible faktorer fra degenereres netthinnen økning MCs betydelig glial fibrillary Sure protein (GFAP) uttrykk. Derfor kan GFAP merking brukes som en markør for MC aktivisering som sekundær svar på netthinnen skader og degenerasjon11.
Nylig har utviklet vi en roman tilpasning av fokal skade bruker en laser til å indusere retinal degenerasjon i sebrafisk (Danio rerio). Fokal skade er fordelaktig for å studere bestemte biologiske prosesser som overføringen av celler på skadde området og nøyaktige tidspunktet for hendelser som finner sted under retinal gjenfødelse12. Videre har sebrafisk som den blitt viktige visuelle forskning på grunn av likheter mellom det visuelle systemet og andre virveldyr. Brutto morfologiske og histologiske funksjoner av menneskelige og teleost retinae viser noen forskjeller. Følgelig, menneskelige og sebrafisk retinae inneholder samme store celle klassene organisert i samme lagdelte mønster, der lyset-sensing fotoreseptorer okkupere det ytterste laget, mens retinal projeksjon neurons, ganglieceller, bor i innerste neuronal lag, proksimale linsen. Netthinnen interneurons, amacrine, bipolar, og vannrett celler, lokalisere mellom photoreceptor og ganglion celle lag13. Videre er sebrafisk netthinnen membran-dominert og derfor nærmere human netthinnen enn, for eksempel intensivt studerte gnager netthinnen. Fascinerende forskjell teleoster og pattedyr er den vedvarende neurogenesis fisk netthinnen og retinal regenerasjon etter skade. I sebrafisk, MCs dedifferentiate og megle gjenfødelse skadet netthinnen14,15. Kylling har MCs noen kapasitet også å skrive inn i cellen syklus og dedifferentiate. Etter retinal skade i voksen fisk, MCs vedta visse egenskaper stamfar og stamceller, overføre til skadede netthinnen vev og produsere nye nerveceller16. Gene expression profilering av pattedyr MCs avslørt uventede likheter retinal progenitors, og bevis for innebygde neurogenic potensialet i MCs i kylling, gnagere og aften human netthinnen vokser17. Likevel er regenerativ svaret fugler og pattedyr er lavere sammenlignet med robust svaret i fisk ennå ikke forstått. Forstå endogene reparasjon mekanismer i sebrafisk kan derfor foreslår strategier for stimulerende retinal gjenfødelse pattedyr og mennesker. Ansette endogene reparasjon mekanismen for MCs som et terapeutisk redskap for behandling av pasienter med retinal degenerasjon ville ha enestående betydning for samfunnet vårt.
Her gir vi de nødvendige trinnene nødvendig å ansette degenerasjon/gjenfødelse modellen i ophthalmica forskning. Vi fokuserte først på inducing fokal skade i neurosensory netthinnen, deretter på avbilding av hendelser utvikling i skaden nettstedet og endelig visualisere involvering av tilstøtende MCs. Generelle protokollen er relativt enkelt å utføre og åpner en rekke muligheter for å vurdere netthinnen etterpå.
Protocol
Representative Results
Discussion
Retinal gjenfødelse/degenerasjon i sebrafisk har blitt undersøkt av ulike tilnærminger som cytotoxin-mediert celle død22, mekanisk skade23og termisk skade24. Vi ansatt en 532 nm diode laser skade sebrafisk netthinnen. Dermed tilbyr vår modell flere fordeler. For eksempel, opprettet vi raskt et veldefinert område av skade lokalisert i ytre netthinnen, spesielt i PRs laget. Videre kan denne eksperimentelle set-up endres for å produsere større o…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi takker Martin Zinkernagel, MD, PhD og Miriam Reisenhofer, PhD for henne vitenskapelige inn på etablering modell og Federica Bisignani for hennes utmerket kundestøtte.
Materials
| Acid hematoxylin solution | Sigma-Aldrich, Buchs, Switzerland | 2852 | |
| Albumin | Sigma-Aldrich, Buchs, Switzerland | A07030 | |
| Bovine serum albumin (BSA) | Sigma-Aldrich, Buchs, Switzerland | 5470 | |
| Dako Pen | Dako, Glostrup, Danmark | S2002 | |
| DAPI mounting medium | Vector Labs, Burlingame, CA, USA | H-1200 | |
| Eosin G aqueous solution 0.5% | Carl Roth, Arlesheim, Switzerland | X883.2 | |
| Ethanol | Sigma-Aldrich, Buchs, Switzerland | 2860 | |
| Ethylene diamine tetraacetic acid (EDTA) | Sigma-Aldrich, Buchs, Switzerland | ED | |
| Eukitt | Sigma-Aldrich, Buchs, Switzerland | 3989 | |
| Goat anti-rabbit IgG H&L Alexa Fluor® 488 | Life Technologies, Zug, Switzerland | A11008 | |
| Goat anti-mouse IgG H&L Alexa Fluor® 594 | Life Technologies, Zug, Switzerland | A11020 | |
| Goat normal serum | Dako, Glostrup, Danmark | X0907 | |
| Hydrogel contact lens | Johnson & Johnson AG, Zug, Switzerland | n.a. | 1-Day Acuvue Moist |
| Hydroxypropylmethylcellulose 2% | OmniVision, Neuhausen, Switzerland | n.a. | Methocel 2% |
| Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate | Sigma-Aldrich, Buchs, Switzerland | A5040 | Tricaine, MS-222 |
| Visulas 532s | Carl Zeiss Meditec AG, Oberkochen, Germany | n.a. | 532 nm laser |
| Mouse anti-GS monoclonal antibody | Millipore, Billerica, MA, USA | MAB302 | |
| HRA + OCT Imaging System | Heidelberg Engineering, Heidelberg, Germany | n.a. | Spectralis |
| Heidelberg Eye Explorer | Heidelberg Engineering, Heidelberg, Germany | n.a. | Version 1.9.10.0 |
| Paraformaldehyde (PFA) | Sigma-Aldrich, Buchs, Switzerland | P5368 | |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Sigma-Aldrich, Buchs, Switzerland | P5368 | |
| Rabbit anti-GFAP polyclonal antibody | Invitrogen, Waltham, MA, USA | 180063 | |
| Silicone pin holder | Huco Vision AG Switzerland | n.a. | Cut by hand from silicone pin mat of the sterilization tray accordingly. |
| Slit lamp BM900 | Haag-Streit AG, Koeniz, Switzerland | n.a. | |
| Slit lamp adapter | Iridex Corp., Mountain View, CA, USA | n.a. | |
| Superfrost Plus glass slides | Gehard Menzel GmbH, Braunschweig, Germany | 10149870 | |
| TgBAC (gfap:gfap-GFP) zf167 (AB) strain | KIT, Karlsruhe, Germany | 15204 | http://zfin.org/ZDB-ALT-100308-3 |
| Tris buffered saline (TBS) | Sigma-Aldrich, Buchs, Switzerland | P5912 | |
| Tween 20 | Sigma-Aldrich, Buchs, Switzerland | P1379 | |
| 78D non-contact slit lamp lens | Volk Optical, Mentor, OH, USA | V78C | |
| Xylene | Sigma-Aldrich, Buchs, Switzerland | 534056 | |
| Ocular fundus laser lens | Ocular Instruments, Bellevue, WA, USA | OFA2-0 | |
| 2100 Retriever | Aptum Biologics Ltd., Southampton, United Kingdom | R2100-EU | Steamer |
Referências
- Haddad, S., Chen, C. A., Santangelo, S. L., Seddon, J. M. The genetics of age-related macular degeneration: a review of progress to date. Surv. Ophthalmol. 51 (4), 316-363 (2006).
- Stefano Ferrari, S., Di Iorio, E., Barbaro, V., Ponzin, D., Sorrentino, F. S., Parmeggiani, F. Retinitis Pigmentosa: Genes and Disease Mechanisms. Curr Genomics. 12 (4), 238-249 (2011).
- Berson, E. L. Retinitis pigmentosa. The Friedenwald Lecture. Invest Ophthalmol Vis Sci. 34 (5), 1659-1676 (1993).
- Strettoi, E. A Survey of Retinal Remodeling. Front Cell Neurosci. 9, 494 (2015).
- Hartong, D. T., Berson, E. L., Dryja, T. P. Retinitis pigmentosa. Lancet. 368, 1795-1809 (2006).
- Wang, D. Y., Chan, W. M., Tam, P. O., Baum, L., Lam, D. S., Chong, K. K., Fan, B. J., Pang, C. P. Gene mutations in retinitis pigmentosa and their clinical implications. Clin Chim Acta. 351 (1-2), 5-16 (2005).
- Pierce, E. A. Pathways to photoreceptor cell death in inherited retinal degenerations. BioEssays. 23, 605-618 (2001).
- Tackenberg, M. A., Tucker, B. A., Swift, J. S., Jiang, C., Redenti, S., Greenberg, K. P., Flannery, J. G., Reichenbach, A., Young, M. J. Muller cell activation, proliferation and migration following laser injury. Mol. Vis. , 1886-1896 (2009).
- Newman, E., Reichenbach, A. The Müller cell: a functional element of the retina. Trends Neurosci. 19 (8), 307-312 (1996).
- Kubota, R., Hokoc, J. N., Moshiri, A., McGuire, C., Reh, T. A. A comparative study of neurogenesis in the retinal ciliary marginal zone of homeothermic vertebrates. Brain Res Dev Brain Res. 134, 31-41 (2002).
- Zhao, T. T., Tian, C. Y., Yin, Z. Q. Activation of Müller cells occurs during retinal degeneration in RCS rats. Adv Exp Med Biol. 664, 575-583 (2010).
- DiCicco, R. M., Bell, B. A., Kaul, C., Hollyfield, J. G., Anand-Apte, B., Perkins, B. D., Tao, Y. K., Yuan, A. Retinal Regeneration Following OCT-Guided Laser Injury in Zebrafish. Invest Ophthalmol Vis Sci. 55 (10), 6281-6288 (2014).
- Bilotta, J., Saszik, S. The zebrafish as a model visual system. Int. J. Dev. Neurosci. , 621-629 (2001).
- Fausett, B. V., Goldman, D. A role for alpha1 tubulin-expressing Müller glia in regeneration of the injured zebrafish retina. J Neurosci. 26 (23), 6303-6313 (2006).
- Yurco, P., Cameron, D. A. Responses of Müller glia to retinal injury in adult zebrafish. Vision Res. 45, 991-1002 (2005).
- Ashutosh, P. J., Roesch, K., Cepko, C. L. Development and neurogenic potential of Müller gial cells in the vertebrate retina. Prog Retin Eye Res. 28 (4), 249-262 (2009).
- Xia, X., Ahmad, I. Unlocking the Neurogenic Potential of Mammalian Müller Glia. Int J Stem Cells. 9 (2), 169-175 (2016).
- Brand, M., Granato, M., Nüsslein-Volhard, C., Nüsslein-Volhard, C., Dahm, R. Keeping and raising zebrafish. Zebrafish: A Practical Approach. , 7-38 (2002).
- Riepe, R. E., Norenburg, M. D. Müller cell localisation of glutamine synthetase in rat retina. Nature. 268 (5621), 654-655 (1977).
- Derouiche, A., Rauen, T. Coincidence of L-glutamate/L-aspartate transporter (GLAST) and glutamine synthetase (GS) immunoreactions in retinal glia: evidence for coupling of GLAST and GS in transmitter clearance. J Neurosci Res. 42 (1), 131-143 (1995).
- Bignami, A., Dahl, D. The radial glia of Müller in the rat retina and their response to injury. An immunofluorescence study with antibodies to the glial fibrillary acidic (GFA) protein. Exp Eye Res. 28 (1), 63-69 (1979).
- Sherpa, T., Fimbel, S. M., Mallory, D. E., Maaswinkel, H., Spritzer, S. D., Sand, J. A., Li, L., Hyde, D. R., Stenkamp, D. L. Ganglion cell regeneration following whole-retina destruction in zebrafish. Dev Neurobiol. 68 (2), 166-181 (2008).
- Cameron, D. A., Carney, L. H. Cell mosaic patterns in the native and regenerated inner retina of zebrafish: implications for retinal assembly. J Comp Neurol. 416 (3), 356-367 (2000).
- Raymond, P. A., Barthel, L. K., Bernardos, R. L., Perkowski, J. J. Molecular characterization of retinal stem cells and their niches in adult zebrafish. BMC Dev Biol. 6, 36 (2006).
- Bailey, T. J., Davis, D. H., Vance, J. E., Hyde, D. R. Spectral-domain optical coherence tomography as a noninvasive method to assess damaged and regenerating adult zebrafish retinas. Invest Ophthalmol Vis Sci. 53 (6), 3126-3138 (2012).
- Koinzer, S., Saeger, M., Hesse, C., Portz, L., Kleemann, S., Schlott, K., Brinkmann, R., Roider, J. Correlation with OCT and histology of photocoagulation lesions in patients and rabbits. Acta Ophthalmol. 91 (8), e603-e611 (2013).
- Wan, J., Zheng, H., Chen, Z. L., Xiao, H. L., Shen, Z. J., Zhou, G. M. Preferential regeneration of photoreceptor from Müller glia after retinal degeneration in adult rat. Vision Res. (2), 223-234 (2008).
- Thomas, J. L., Thummel, R. A novel light damage paradigm for use in retinal regeneration studies in adult zebrafish. J Vis Exp. (80), e51017 (2013).
