Preparación de hidrolizado de queratina de plumas de pollo y su aplicación en cosméticos

Summary

El objetivo del protocolo es preparar hidrolizado de queratina de plumas de pollo por hidrólisis alcalina y enzimática y para probar si la adición de hidrolizado de queratina en una base para ungüentos cosméticos mejora la función barrera de la piel (aumentan la hidratación y disminuye la pérdida transepidérmica de agua). Las pruebas se realizan en hombres y mujeres voluntarios.

Abstract

Hidrolizados de queratina (KHs) son componentes estándar establecidos en cosmética capilar. Comprender los efectos hidratantes de KH es ventajoso para los cosméticos del cuidado de la piel. Los objetivos del protocolo son: (1) para procesar plumas de pollo en KH por hidrólisis alcalina enzimática y purificar por diálisis y (2) para comprobar si la adición de KH en una base de ungüento (OB) aumenta la hidratación de la piel y mejora la función barrera de la piel disminuyendo pérdida de agua transepidérmica (TEWL). Durante la hidrólisis alcalina enzimática plumas primero se incuban a una temperatura mayor en un ambiente alcalino y luego, en condiciones suaves, hidrolizadas con enzimas proteolíticas. La solución de KH se dializaron, vacío secado y molido a un polvo fino. Se preparan formulaciones cosméticas que comprende aceite en emulsión en agua (O/W) contiene 2, 4 y 6% de peso de KH (basado en el peso del OB). Prueba las propiedades hidratantes del KH se lleva a cabo en 10 hombres y 10 mujeres en intervalos de 1, 2, 3, 4, 24 y 48 h. comprobado formulaciones se extienden en los sitios de antebrazo volar desengrasado. La hidratación de la piel del estrato córneo (SC) se evalúa mediante la medición de la capacitancia de la piel, que es uno de los métodos usados y simples de más por todo el mundo. UREA se basa en medir la cantidad de agua transportada por un área definida y un período de tiempo de la piel. Ambos métodos son completamente no-invasivo. KH es una oclusiva excelente; dependiendo de la adición de KH en OB, trae consigo una reducción de 30% de urea después de la aplicación. KH también funciona como un humectante, como se une el agua de las capas inferiores de la epidermis a la SC; el agregado óptimo de KH en el OB, hasta 19% aumento de la hidratación en los hombres y 22% aumento en las mujeres ocurre.

Introduction

Los mataderos, la industria alimentaria y la industria del curtido producen anualmente enormes cantidades de subproductos sólidos queratina – lana, plumas, cerdas, pezuñas, garras, cuernos y similares. Según los últimos datos estadísticos, el peso vivo total de pollos, pavos, patos y otras aves de corral sacrificadas en los E.e.u.u. es 62,5 billones de libras por año¹; en la UE es aproximadamente 28,7 billones de libras al año. Teniendo en cuenta que plumas hacen hasta el 8.5% del peso total de las aves de corral, los Estados Unidos solo produce anualmente aprox. 5,3 billones de libras de residuos plumas².

La queratina es una proteína exhibe alta resistencia química debido a que es fuertemente reticulado con puentes disulfuro que hacen difícil su tratamiento. Obtención de productos solubles requiere hendiendo enlaces cruzados y posiblemente realizar la hidrólisis de los enlaces peptídicos³. Ruptura de los puentes de disulfuro se puede proceder a través de una reacción del anión tiol según el siguiente patrón^4,5:

S_una^– + – S_bS_c-↔ – S_b^– + – S_aS_c^–

Con un nivel de pH muy alto, hidrólisis de los puentes de disulfuro también aparece, según el patrón⁶

SS –^– + → OH^– – S^– – SOH

Condiciones suaves (pH aprox. 8), incluso sulfitolysis tiene lugar según el siguiente patrón:

SS – – + HSO₃^– → – SH – SSO₃^–

La forma más económica de degradar queratina es descomposición microbiana, que se caracteriza por las condiciones de reacción suaves durante el proceso y alta avería eficiencia (aprox. 90%)^7,8. Keratinases son producidas por algunas bacterias aisladas del suelo y la queratina residuos⁹. Keratinases microbianas hidrolizar queratina rígidas y fuertemente reticulado estructuras¹⁰ y el KH resultante preparado es rico en proteínas solubles, sin pérdida de aminoácidos detectados en ella¹¹.

Para incorporar proteínas en preparaciones cosméticas (por ejemplo, emulsiones, lociones y geles), los requisitos de aseguran que estas proteínas son solubles en agua, los sistemas dados son transparentes, y la agregación de los péptidos se evita debido a interacciones hidrofóbicas. Por lo tanto, una práctica común es aplicar hidrolizados de proteínas, como el hidrolizado de colágeno, elastina y queratina. Al agregar hidrolizados en emulsiones cosméticas, son pasos para asegurar que el hidrolizado primero se disuelve en agua. En algunos casos, es deseable que las proteínas (hidrolizado) es soluble en alcohol u otros solventes orgánicos¹².

KH normalmente aparece en champús, acondicionadores, lociones y sueros nutritivos para el cabello, así como máscaras, esmalte de uñas y agentes del maquillaje del ojo. Los efectos KH declarados generalmente incluyen formando una película protectora, alisa el cabello o uñas de estructura, una mayor plasticidad y aspecto de la formación tratada, regulación de la consistencia de los productos y alentar la formación de espuma^{13 , 14}. también se ha demostrado que KH reduce la tensión superficial, por lo tanto, la suplementación en cosméticos puede facilitar la reducción en la cantidad de emulsionante agregado para estabilizar cremas. KH limitar los efectos de la irritación provocada por detergentes (surfactantes) a la piel, ojos y cabello, reduciendo así los efectos secundarios potenciales de limpieza sobre el tejido (p. ej., deshidratación de la piel, la dureza y la función de barrera disminuida de la piel). La alta capacidad de almacenamiento en búfer de hidrolizados es explotada también para estabilizar el pH de los cosméticos; péptidos de longitud más corta tienen un efecto tampón mayor^15,16. Aunque KHs se han establecido como componentes estándar en el cabello y cosméticos de uñas como se utiliza en productos para el cuidado de la piel, estudios sobre los efectos hidratantes de KH no aparecen en la literatura contemporánea.

Tecnología alcalina enzimática ha sido desarrollada para el procesamiento de productos derivados de queratina en KH, y activa la prueba es en proceso sobre los efectos de una serie de aditivos cosméticos^{17,18,19,20 , 21 , 22}. la ventaja de dos etapas hidrólisis alcalina enzimática utilizando proteasas microbianas de plumas de pollo logra alta eficiencia bajo condiciones suaves de reacción y la calidad de KH es muy alta en contraste con hidrólisis en ácidos fuertes o álcalis. En la primera etapa, las plumas se incuban a una temperatura mayor en un ambiente alcalino, que altera la estructura de queratina parcialmente y se hincha las plumas; después de ajustar el pH, las plumas son hidrolizadas con una enzima proteolítica condiciones suaves en la segunda etapa. El KH dializado posee un alto contenido de proteínas.

Los propósitos del método descrito aquí son procesar plumas de aves en un KH mediante hidrólisis alcalina enzimática y prueba el efecto de las propiedades hidratantes de KH aplicado en emulsión cosmética O/W. Las propiedades hidratantes son investigadas por métodos no invasivos instrumental en vivo. Los métodos más frecuentes para medir la función de la hidratación y la barrera de la piel de SC incluyen medición de propiedades eléctricas de la piel (conductancia o capacitancia). Diferentes métodos para la investigación de hidratación SC incluyen cerca de método imaginando multiespectral infrarrojo (NIM), espectroscopia de resonancia magnética nuclear, tomografía de coherencia óptica o transferencia térmica transitorio²³. Función de barrera de SC correlaciona a la urea de SC y se mide por el método de cámara ventilada, método de ventilación de la cámara y cámara abierta método²⁴.

Propiedades de las formulaciones del modelo se determinan usando el adaptador de sonda Multi 5 MPA con tres tipos de sondas. El primero de ellos, corneometer CM 825, hidratación de la piel de medidas mediante la evaluación de cambios en la capacidad eléctrica de la superficie de la piel; el condensador mide muestra cambios en la capacitancia de la superficie de la piel en las corneometric unidades. El corneometer da sólo una evaluación relativa de la piel hidratación²⁵. De urea, la segunda sonda, el tewameter TM 300, se utiliza para medir el gradiente de densidad de la evaporación del agua (en un instrumento de cámara abierta basada en el derecho de difusión de Fick) de la piel indirectamente por los dos pares de sensores (temperatura y humedad relativa) indicando la cantidad de agua transportada por un área definida y un período de tiempo (g/m2/h). Este método puede detectar incluso la más leve alteración de piel barrera función²⁶. PH de la piel es un indicador de barrera y función anti-microbiana de la SC²⁷. La acidez de la capa de piel fue medida por un sensor de piel PH 905 (tercero) conectado a la estación de 5 MPA. Esta sonda especialmente diseñada consta de un electrodo de vidrio plana para contacto de la piel completo, conectado a un voltímetro. El sistema mide los cambios de potencial debido a la actividad de los cationes de hidrógeno que rodea la capa muy delgada de formas semi-sólidas medido en la parte superior de la sonda. Los cambios en el voltaje se muestran como pH²⁸.

Presentamos experimentos divididos en tres secciones: (1) preparación de KH de pollo plumas por hidrólisis alcalina enzimática de dos etapas y su purificación por diálisis (eliminación de sales y las fracciones de peso molecular bajo), (2) preparación de cosméticos formulaciones que contienen 2, 4 y 6% KH y (3) pruebas de las propiedades de KH midiendo TEWL, hidratación de la piel y pH de la piel. La prueba se realizó en 10 mujeres con edad media de 27,2 años y 10 hombres con la edad media de 26,2 años. El método de selección de los voluntarios y las pruebas se realizaron con arreglo a los principios éticos internacionales de investigación bio-médica utilizando seres humanos²⁹; todas las personas que dieron su consentimiento informado antes de la inclusión en el estudio. Antes del ensayo comenzó, los voluntarios debían completar un cuestionario sobre su estado de salud. Los voluntarios comprometidos para evitar aplicar cualquier producto cosmético a los sitios de prueba y las regiones circundantes durante las 24 h antes y durante el período de prueba; Además, sólo se les permitió la noche breve lavados con agua corriente.

Protocol

Se reclutaron voluntarios entre empleados y estudiantes de nuestra Universidad. El método de selección se llevó a cabo según “normas eticas internacionales para biomédica investigación involucra sujetos humanos. Consejo de organizaciones internacionales de ciencias médicas, Ginebra (2002).” KH es un ingrediente cosmético común utilizado en productos de cuidado del cabello (champús, acondicionadores, etc.) y por lo tanto no es necesaria la aprobación de la Junta de revisión institucional. <p clas…

Representative Results

El KH preparado según el procedimiento presentado aquí (ver figura 2) es de color amarillo en el color, fácilmente soluble en agua con alto contenido de proteína (sólidos inorgánicos representan < 2.0%); el pH de la solución al 1.0% de KH es de 5.3 y cumple con los requisitos para hidrolizados de grado cosmético. El rendimiento de KH de 50 g materia prima es de aprox. 30%. La distribución de peso molecular de KH fue determinada por SDS-PAGE y se mues…

Discussion

La ventaja de la hidrólisis alcalina enzimática es que puede ser modificado según las aplicaciones futuras de KH. Por ejemplo, en aplicaciones de cosméticos de cuidado del cabello donde un color ligeramente amarronado de un producto no es un obstáculo, una temperatura más alta en la hidrólisis puede aplicarse a un rendimiento superior de KH. Además, el tiempo de procesamiento durante ambas etapas del procedimiento tecnológico afecta significativamente el proceso general de eficiencia: rendimiento de KH se eleva …

Materials

Material or chemicals
LIPEX 100T	Novozymes	LJP30020	Lipex – enzyme produced by submerged fermentation of a genetically-modified microorganism, activity 100 KLU/g
Savinase Ultra 16L	Novozymes	PXN40001	Savinase – enzyme produced by submerged fermentation of a genetically-modified microorganism, activity 16 KNPU-S/g
Potassium hydroxide, KOH	Sigma-Aldrich	302510289	Potassium hydroxide, KOH, 97,0 %, Mr 56,11
Phosphoric acid solution, H3PO4	Sigma-Aldrich	W290017	Phosphoric acid solution, H3PO4, 85 wt. % concentration in water, Mr 98,00
Sodium chloride physiological solution	Sigma-Aldrich	52455	Tablets of BioUltra NaCl physiological solution; 1 tablet in 1000 mL of water yields 0.9 % NaCl
Sodium hydroxide, NaOH	Penta s.r.o.	40216	Sodium hydroxide, NaOH, 97,0 %, Mr 40,00
AmiFarm (Cremor base-A)	Fagron	608425	Hydrophilic oil in water (O/W) cream base; the composition: aqua, paraffin, paraffin liquid, cetearyl alkohol, Laureth 4, sodium hydroxide, carbomer, methylparaben, propylparaben.
Name	Company	Catalog Number	Comments
Equipment
IKA EUROSTAR POWER control-visc stirrers	IKA-labortechnik	Z404020	Digital laboratory stirrer, for tasks up to the high viscosity range, 230V, 1/cs
IKA Propeller stirrer, 3-bladed	IKA-labortechnik	R 1381	Propeller stirrer, 3-bladed, stirrer Ø: 45 mm, shaft Ø: 8 mm, shaft length: 350 mm
Dialysis tubing closures	Sigma-Aldrich	Z371017-10EA	Dialysis tubing closures, red, size 110 mm
Dialysis tubing cellulose membrane	Sigma-Aldrich	D9402-100FT	Dialysis tubing cellulose membrane, average flat width 76 mm (3.0 in.)
DOMO Pot with stailess, LCD	DOMO Elektronic	DO42325PC	Preserving boiler stainless steel, 2000 W, 27-L container (diameter 37 cm, height 30 cm), temperature control 30-100 ° C, operation LCD display
Hettich zentrifugen Universal 32	Gemini bv	2770 GS1R	Mid bench centrifuge, speed 18000 rpm
LT 3 shaking device	Fischer Scientific	6470.0002	Orbital shaking device
KERN 440-47N	Kern	440-47N	Laboratory balance
KERN 770	Kern	770 -N	Laboratory analytical balance
VENTICELL 222 – Komfort	BMT, MMM Group	C 131749	Drying oven, temperature control 30-100 ° C, air circulation control
Vacucell 55 – EVO	BMT, MMM Group	B 050328	Vacuum drying oven, temperature control 30-100 ° C
PULVERISETTE 19	Fritsch	19.1030.00	Universal cutting mill, rotor with V-cutting edges and fixed knives
Multi Probe Adapter System MPA 5	Courage & Kazaka Electronic	10225237	MPA 5 Station – equipment for measurement hydratation, TEWL and pH
Skin pH-meter PH 905 probe	Courage & Kazaka Electronic		Probe to specifically measure the pH on the skin surface or the scalp
Corneometer CM 825 probe	Courage & Kazaka Electronic		Probe to determine the hydration level of the skin surface (Stratum corneum).
Tewameter TM 300	Courage & Kazaka Electronic		Probe for the assessment of the transepidermal water loss (TEWL)
Heidolph RZR 2020	Heidolph	13-225-007-03-1	Overhead stirrer, mechanical speed setting and stepless transmission; speed range 40-2000 rpm
Heidolph mechanical stirrer BR 10	Heidolph	Z336688-1EA	Blade impeller crossed stirrer
Fagor FS 12	Fagor	BTT-138	Laboratory refrigerator with freezer space
WTW bench pH/mV meter	WTW	Z313165	High-performance bench pH and pH/conductivity meters for routine and high precision laboratory measurements in research or quality control laboratories
Container	RPC Superfos		13-L plastic bucket, diameter 26 cm, height 26 cm
Name	Company	Catalog Number	Comments
Software
Microsoft Office 2010	Microsoft
C+K software	Courage and Khazaka Electronic GmbH		MPA 5 station operating software