Eine Methode zur Bewertung von Fc-vermittelten Effektor-Funktionen durch Influenza Hämagglutinin spezifische Antikörper induziert
Summary
Wir beschreiben eine Methode, um der Aktivierung des Fc-vermittelten Effektor-Funktionen durch Antikörper dieses Ziel der Influenza Virus Hämagglutinin messen. Dieser Test kann auch angepasst werden, um die Fähigkeit der monoklonale Antikörper oder polyklonalen Seren gezielt andere virale Oberfläche Glykoproteine induzieren Fc-vermittelten Immunität zu beurteilen.
Abstract
Antikörper spielen eine entscheidende Rolle bei der Kopplung der angeborenen und der adaptiven Immunantwort gegen virale Erreger durch Antigen-bindenden Domänen und Fc-Regionen. Wir beschreiben hier, wie die Aktivierung gemessen Effektor-Funktionen durch monoklonale Antikörper gezielt die Influenza Virus Hämagglutinin mit dem Einsatz einer gentechnisch Jurkat-Zelllinie, die mit dem Ausdruck einer Aktivierung Art von Fc 1. Fc-FcγR. mit dieser Methode, die Beitrag der spezifischen Fc-FcγR-Wechselwirkungen durch Immunglobuline übertragenen kann durch ein in-vitro- Test bestimmt werden.
Introduction
Immunität von der saisonalen Grippe-Impfstoff zur Verfügung gestellt wurde traditionell durch Hämagglutination Inhibition (HI) Assay1bewertet, das Vorhandensein von Antikörpern, die auf die Rezeptor-Bindungsstelle des das Hämagglutinin misst. Diese HI-aktive Antikörper sterilisieren Immunität verleihen können, aber sind in der Regel eng in ihrer Breite von Schutz, bietet Immunität gegen nur eine ausgewählte einige Stämme des Influenza-Virus. Die Isolierung und Charakterisierung von weitgehend reaktiven monoklonalen Antikörpern, die das Hämagglutinin (HA) erkennen schlagen vor, dass die Entwicklung eines universellen Grippeimpfstoffs in Reichweite2,3,4, 5 , 6 , 7 , 8. ist eines der Hauptziele des universellen Grippeimpfstoffs induzieren eine starke Antikörperantwort auf die konservierten Bereiche des Influenza-Virus9,10,11,12 , 13 , 14 , 15 , 16. im großen und ganzen Antikörper, die diese konservierten Epitope, bestehend aus neutralisierende und nicht neutralisierende Antikörper17,18erkannt haben gezeigt, dass Fc-FcγR Interaktionen für erfordern optimale Schutz in Vivo und Highlight des Beitrags der Fc-vermittelten Immunität gegen die allgemeine Immunantwort auf Influenza Virus19,20.
Korrelate des Schutzes sind entscheidend bei der Beurteilung der Immunität gegen Infektionen. Diese Metriken ermöglichen Wissenschaftlern und Klinikern, die Wirksamkeit von Impfstoffen, die Bedeutung der Daten und der Verlauf der Behandlung zu schätzen. Das einzige etablierte Korrelat der Schutz gegen Influenza-Virus-Infektion ist die Hämagglutination Inhibition Assay. Ein Titer von 01:40 ist mit einer 50 % Reduktion des Risikos von Krankheit1,21 – und spiegelt das Vorhandensein von Antikörpern, die Agglutination zu hemmen, indem Sie auf den Rezeptor verbindlich vor Ort auf den kugelförmigen Kopf des HA. Allerdings sei auch darauf hingewiesen, dass T-Zell-Reaktionen möglicherweise eine bessere Korrelat der Schutz gegen Influenza-Virus-Infektion bei älteren Menschen. Ein kürzlich veröffentlichten Bericht zufolge Interessanterweise Neuraminidase Hemmung Tätigkeit ein besserer Prädiktor der Immunität gegen Grippe22sein kann. Glücklicherweise Tests typische in-vitro- , wie z. B. Neutralisation oder Neuraminidase Hemmung Assays HA Stiel oder Neuraminidase-spezifische Antikörper messen können. Die meisten dieser konventionellen in-vitro- Tests jedoch nur berücksichtigen sowohl die Funktion des Antigen-Bindung-Region des Antikörpers und Messen nicht die Rolle der Fc-Region. Darüber hinaus sind der Beitrag der nicht neutralisierende Antikörper, die über Fc-Rezeptor Engagement in Vivo zu schützen nicht erkannten17,18. Um Schutz durch Antikörper, die Fc-vermittelten Immunität wie Antikörper abhängige Zelle vermittelten Zytotoxizität (ADCC) induzieren zu messen, braucht man ein robuste in-vitro- Assay.
Die unten beschriebene Methode beurteilt die Fähigkeit von murinen monoklonalen Antikörpern, Fc-vermittelten Funktionen durch den Einsatz von gentechnisch veränderten Jurkat Zell-Linie mit dem Ausdruck einer Aktivierung induzieren Murine Typ 1 FcR, FcγRIV. Antikörper-Engagement von der FcγR transduces intrazellulären signalisieren, dass Trigger nuklearen Faktor der aktivierten T-Zellen vermittelten Luciferase-Aktivität. Der Test hat mehrere Vorteile gegenüber herkömmlichen Techniken, die Isolierung und Kultur der primären Effektorzellen und die Verwendung der Durchflusszytometrie zur Aktivierung von Fc-vermittelten Effektor-Funktionen19,23,24 Erkennung erfordern ,25,26. Erstens kann das Protokoll hier beschriebenen leicht verschiedene virale Ziele, FcγRs und Antikörper verschiedener Arten (menschliche und murine) integrieren angepasst werden. Zweitens die Verwendung einer modifizierten Jurkat-Zelle Zeile zum Ausdruck zu bringen, die eine FcγR mit einer Luciferase Reporter-gen unter einem nuklearen Faktor von aktivierten T-Zellen (NFAT) für einen Großformat-Assay ermöglicht, die mit einer Platte Reader Messung der Lumineszenz leicht analysiert werden können. Hier wird die traditionelle Aktivierung des primären Effektorzellen mit der Induktion von NFAT-Luciferase auf Antikörper Engagement von einer FcγR auf der Oberfläche der Zelle Jurkat ersetzt. 96-Well-Platte Format Assays kann für die Messung von bis zu vier verschiedene Proben in Triplicates mit sieben Verdünnungen – eine Reihe von Proben, die umständlich mit traditionellen Techniken werden könnte. Gibt es weitere Punkte, die mit dieser Assay, die das Design von Experimenten und die Interpretation der Daten beeinträchtigen können. Das virale Ziel muss auf der Zelloberfläche in Reihenfolge für die Antikörper Anerkennung ausgesprochen werden. Um dies zu mindern, kann das Ziel-Antigen (z.B. eine interne virale Proteine) direkt auf die Oberfläche der Platte beschichtet werden. Allerdings hat dies noch nicht rigoros getestet. Darüber hinaus die modifizierte Zellinie Jurkat drückt nur eine Art der Aktivierung FcγR und drückt keine hemmenden FcγRs während Primärzelle Linien alle Rezeptoren in einem physiologischen Kontext auszudrücken.
Wir haben zuvor dieser Assay verwendet, um zu zeigen, dass Epitop-Spezifität in einem polyklonalen Kontext eine entscheidende Rolle spielt bei der Regulierung der Fc-vermittelten Effektor-Funktionen und optimale Aktivierung des Antikörper-abhängige zellvermittelte Reaktion zwei Punkte erfordert wenden Sie sich an27,28. Hier beschreiben wir eine Methode, die bewertet die Fähigkeit von Stiel-spezifischen monoklonalen Antikörpern zu engagieren und aktivieren die Murine FcγRIV aktivieren. Zwar gibt es Ausnahmen29,30, eine große Anzahl von weitgehend Antikörper Ziel antigenetisch erhaltenen Stiel und Umgebung das Hämagglutinin und somit eine wichtige Rolle bei der Entwicklung einer universellen Grippe Impfstoff.
Protocol
Representative Results
Discussion
Die hier beschriebene Methode ermöglicht dem Benutzer die Fähigkeit eines HA-spezifischen monoklonalen Antikörpers, der murinen FcγRIV zu messen. Das Ziel-Antigen, Influenza Virus Hämagglutinin, drückt sich auf der Oberfläche der Zellen nach der Infektion durch Viren oder Transfektion von Plasmid DNA. Der Test ist ein weiterer mit verschiedene Oberfläche ausgedrückt virale Proteine in Kombination mit anderen FcγRs (Menschen oder Murine) zugänglich. Darüber hinaus wir haben verwendet Sera Proben um zu beurteil…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dieses Projekt wurde teilweise mit Bundesmitteln aus dem National Institute of Allergy and Infectious Diseases finanziert, National Institutes of Health, Department of Health And Human Services, unter CEIRS Vertrag P01AI097092-04S1 (P.E.L.).
Materials
| A549 cells | ATCC | CCL-185 | Adenocarcinomic human alveolar basal epithelial cells |
| HEK 293T cells | ATCC | CRL-3216 | Human embryonic kidney cells |
| Lipofectamine 2000 | Life Technologies | 11668019 | Transfection reagent |
| 1X Opti-MEM Reduced Serum Medium | ThermoFisher Scientific | 51985-034 | |
| White tissue culture treated 96-well plate | Corning, Inc. | 3917 | Assay plates |
| 10X MEM | Gibco | 11430-030 | |
| Jurkat cell expressing murine FcgRIV | Promega | M1201 | Kit provides includes cells, Bio-Glo Luciferase assay system, 1X RPMI and low IgG serum |
| Jurkat cell expressing human FcgRIIIa | Promega | G7010 | Kit provides includes cells, Bio-Glo Luciferase assay system, 1X RPMI and low IgG serum |
| Jurkat cell expressing human FcgRIIa | Promega | G9901 | Kit provides includes cells, Bio-Glo Luciferase assay system, 1X RPMI and low IgG serum |
| Luminometer | BioTek | Synergy H1 Multi-Mode reader | Luminescence plate reader |
| Bio-Glo Luciferase Assay System | Promega | G7940 | Contains luciferase assay buffer and luciferase assay substrate |
| Madin Darby canine kidney cells | ATCC | CCL-34 | Canine kidney cells |
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