Cilier udvikling er afgørende for korrekt organogenesis. Denne protokol beskriver en optimeret metode til at mærke og visualisere ciliated celler af zebrafisk.
I de seneste år opstået zebrafisk embryoet som en populær model til at studere udviklingsmæssige biologi på grund af træk såsom ex utero embryo udvikling og optisk gennemsigtighed. Især er zebrafisk embryo blevet en vigtig organisme at studere hvirveldyr nyre organogenesis samt multiciliated celle (MCC) udvikling. For at visualisere MCC’er i embryonale zebrafisk nyre, vi har udviklet en kombineret protokol af hele-mount fluorescerende i situ hybridisering (FISH) og montere hele immunofluorescens (IF), der giver høj opløsning billeddannelse. Dette manuskript beskriver vores teknik til co lokalisering RNA udskrifter og protein som et redskab til bedre at forstå reguleringen af udviklingsmæssige programmer gennem udtryk af forskellige faktorer, afstamning.
Over de sidste mange årtier fremstod zebrafisk (Danio rerio) som en førsteklasses model organisme at studere udviklingsmæssige biologi. Embryonerne udvikle uden for moderen og gennemsigtige optisk. Dannelsen af vitale organer såsom øjet, nyre og forhjernen forekommer også, hurtigt, med strukturer dannet af bare 24 timer post befrugtning (hpf). Vigtigere, er zebrafisk genom meget bevaret med pattedyr1,2,3. Desuden har zebrafisk og pattedyr organer lignende anatomi og fysiologi. Zebrafisk embryonale nyre, eller pronephros, viser værdien af modelsystem til at undersøge genfunktion under begyndelsen nephrogenesis og skæbne bestemmelse af bevarede epitelcelle populationer af hvirveldyr nephron4, 5 , 6 , 7 , 8 , 9 , 10. på samme måde zebrafisk embryo er blevet stadig vigtigere i undersøge Ontogeni af MCC’er11,12,13,14,15, 16 , 17.
Som navnet antyder, er MCCs epitelceller karakteriseret ved et bundt af motile cilia beliggende på den apikale overflade17. I zebrafisk, MCCs fungere i flydende flow og er spredt i en “salt” ligesom mode i hele midten af hvert nephron af pronephros af 24 hpf11,12,13,14, 15 , 16 , 17. selv om de er kun blevet bemærket i en håndfuld af menneskelige nyre sygdom tilfælde18,19,20,21, MCCs er udbredt i andre pattedyr væv som hjernen og luftrør22,23,24, som indebærer en række udfordringer for eksperimentelt design. Elegant undersøgelser i forskellige hvirveldyr modeller herunder zebrafisk viste en bevaret pathway af MCC skæbne, med hakket signalering pathway som en hæmmer af MCC udvikling12,17,25 ,26,27. Derfor giver zebrafisk pronephros et lettilgængeligt model til at studere de genetiske mekanismer af MCC udvikling i vivo11,12,13,14, 15 , 16 , 17.
Både gennemsigtighed og let genetiske manipulering af zebrafisk embryoner har vist sig for at være uvurderlig karaktertræk, når man studerer den genetiske og molekylære veje, der regulerer celle skæbne, væv vækst og udviklingen af det tidlige embryon1,2 ,3. Som sådan, traditionelle teknikker til at visualisere protein og gen afskrifter, som i situ hybridisering og hele mount IF, har været anvendt til og optimeret til zebrafisk16,28,29, 30,31,32,33,34,35,36,37,38. Ved at kombinere populære protokoller for fisk og hvis, er det muligt at mærke og analysere MCC’er i vivo16,28,37,38.
Den protokol, der er beskrevet ovenfor er optimeret til mærkning MCC’er i pronephros med odf3b afskrifter og α-tubulin i 24 hpf zebrafisk embryoner. For de bedste resultater anbefales det at bruge frisk fast og forberedt embryoner. Embryoner, der er blevet fast og gemt i enten MeOH eller Hyb + ved-20 ° C i længere end en uge kan bruges, men sandsynligheden for uønsket baggrund farvning stiger med det tidspunkt, hvor embryonerne opbevares i opbevaring.
Ændringer og fejlfinding af denne teknik er nødvendige for at tilpasse denne metode for andre suites særlige markører, fx andre antisense riboprobes og andre antistoffer. Mange metoder til at justere parametrene for trin ved at hele mount i situ hybridisering har været tidligere dokumenteret af vores gruppe og andre31,34,36,38, 39. Ligeledes hvert protein antistof vil kræve nogle fejlfinding i form af farvning gange, og omtrentlige intervaller af fortyndinger og inkuberingstider for hver primære antistof skønnes bedst ved evaluering af dokumenterede resultater28, 35. for embryoner yngre end 24 hpf, pK behandling bør være kortere end 2 min, hvor embryoner ældre end 24 hpf bør behandles med pK i længere tid end 2 min. Også, embryoner ældre end 24 hpf bør blive bleget af pigment før pK behandling.
Efter farvning med fluorescerende Farvningsopløsningen, er det kritisk at fjerne eventuelle resterende farvning, antistof og peroxidases ved at udføre serien af methanol og hydrogenperoxid vasker. PBS vasker umiddelbart efter er afgørende for at fjerne overskydende metanol fra embryoner. Vigtigere, før du fortsætter med hvis antistoffer, har vi fundet, at acetone og deioniseret vand vasker gøre embryoner mindre tilbøjelige til at overholde hinanden og/eller centrifugeglas. I vores erfaring, antistoffer for bestemte transkriptionsfaktorer og andre gener, selvom de kan arbejde effektivt Western blotting, virker ikke godt for hvis i zebrafisk. Dog fungerer særdeles velbevarede, og rigelige proteiner, såsom α-tubulin og β-catenin, godt i zebrafisk for hvis16,37.
Med fisk er det muligt at visualisere RNA udskrifter af gener, der endnu ikke har specifikke antistoffer i zebrafisk. Ved at kombinere fisk med hvis, som det fremgår af denne protokol, kan Co lokalisering af RNA udskrifter og protein være set i vivo (figur 2). Fleksibiliteten i protokollen giver mulighed for hurtig fejlfinding for visualisering af forskellige RNA udskrifter og proteiner i mange væv og tidspunkter. Når det kombineres med de allerede respekterede træk af zebrafisk embryoner, giver denne protokol af fisk + hvis et andet værktøj til at udforske udtryk af gener og proteiner vigtigt at udviklingsmæssige pathway forordning.
The authors have nothing to disclose.
Dette arbejde blev støttet i en del af tilskuddet R01DK100237 til R.A.W. og feltet National Science Foundation Graduate Research Fellowship. DGE-1313583 til A.N.M. Vi takker også College af videnskab sommer Undergraduate Research Fellowship Program for støtte til M.U. Vi vil gerne takke centeret for zebrafisk forskning ved University of Notre Dame for deres dedikeret pleje af vores zebrafisk. Vi vil også gerne takke Biologisk Institut samt medlemmerne af vores lab for alle deres støtte og værdifulde indsigter.
non-specific protease mixture solution | Roche | 11459643001, pronase from Streptomyces griseus | Dilute in E3 without methylene blue to make 50mg/mL stock solution; store at -20°C |
E3 solution | Dilute 50X E3 (250 mM NaCl, 8.5 mM KCl, 16.5 mM CaCl2, 16.5 mM MgSO4 in distilled water) in distilled water; add 1 x 10-5 M methylene blue (sigma M9140) to inhibit contamination | ||
tricaine (ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate) | Fluka | A5040-250G | To make a 0.2% stock solution, dissolve 1 g of tricaine powder in 10 mL Tris, pH 9.5 and distilled water up to 500 mL |
embryo dishes | VWR | 351029 | |
5 mL glass vials | Wheaton | 225012 | |
disposable plastic Pasteur pippettes | VWR | 414004-004 | |
4% paraformaldehyde (PFA) solution | Electron Microscopy Services | 19210 | Dissolve 4% PFA in 1X PBS and bring to a boil under a fume hood. Cool and aliquot, then store at -20°C. Do not refreeze once thawed for use. |
10X PBS | American Bioanalytical | AB11072 | Dilute in distilled water to make a 1X stock |
Tween-20 stock | American Bioanalytical | AB02038 | Make a 0.1% Tween-20 stock by diluting in distilled water. |
1X phosphate buffered saline with 0.1% Tween 20 (PBST) | Sigma | P9416 | 0.1% Tween-20 in 1X PBS |
methanol (MeOH) | Sigma | 34860-4L | |
proteinase K | Roche | 3115879001 | Dissolve in distilled water to make a 10 mg/mL stock; aliquot and store at -20°C |
flat bottom microcentrifuge tubes | VWR | 87003-300; 87003-298 | |
formamide | American Bioanalytical | AB00600 | store at -20°C |
hybridization solution (HYB+) | 50% formamide, 5X SSC, 0.1% Tween-20, 5 mg/mL yeast torula RNA, 50 μg/μL heparin; store at -20°C | ||
hybridization oven | Fisher Scientific | 13-247-10Q | |
20X saline-sodium citrate (SSC) buffer solution | American Bioanalytical | AB13156 | dilute in distilled water to make 2X and 0.2X stocks |
blocking reagent solution | Roche | 11096176001 | dilute in maleic acid buffer to make a 10% stock solution; store at 4°C |
maleic acid buffer solution | Sigma | M0375 and S7653 | 150mM maleic acid, 100mM NaCl (pH 7.5) |
anti-Digoxigenin-POD, Fab fragments | Roche | 11207739910 | store at 4°C |
Cy3 fluorescent staining solution | PerkinElmer, Inc. | NEL744001KT, TSA Plus Cyanin3 system | store at 4°C; prepare staining solution fresh by making a 1:50 dilution of TSA reagent (dissolved in 60 uL of DMSO) in the kit buffer |
Hydrogen peroxide (H2O2) | Sigma | H1009-500mL | store at 4°C |
molecular grade distilled water (ddH2O) | Mediatech | 25-055-CM | |
acetone | American Bioanalytical | AB00636-01000 | store an aliquot at -20°C |
DMSO | American Bioanalytical | AB00435-01000 | |
fetal bovine serum (FBS) | Gibco | 10438-034 | aliquot and store at -20°C |
monoclonal anti-acetylated tubulin clone 6-11B-1 | Sigma-Aldrich | T6793 | aliquot and store at -20°C |
anti-γ-tubulin anitbody produced in rabbit | Sigma-Aldrich | T5192 | aliquot and store at -20°C |
odf3b cDNA clone MGC:63985 | OpenBiosystems | IMAGE:6792478 | store bacterial glycerol stock at -80°C |
NaCL | American Bioanalytical | AB01915-05000 | |
Alexa flour 647 goat anti-rabbit IgG | Life Technologies | A21245 | store at 4°C; protect from light |
Alexa fluor 488 goat anti-mouse IgG | Life Technologies | A11029 | store at 4°C; protect from light |
DAPI | Life Technologies | D1306 | aliquot and store at -20°C |
glass slide | Thermo-Fisher | 4445 | |
glass coverslip | Thermo-Fisher | 12-540A | 18 x 18 mm |
fine forceps | Roboz | RS-1050 | Dumont Tweezers Pattern #55 |
mounting media | Polysciences, Inc. | 18606, Aqua-Poly/Mount | store at 4°C |
confocal microscope and associated software | We use a Nikon C2plus Confocal Microscope with NIS-elements AR software | ||
rocker | Bio-Rad | 1660710EDU |