Sekundær degenerasjon av netthinnen ganglieceller (RGCs) oppstår vanligvis i glaukom. Denne studien beskriver en innovativ operative tilnærming for delvis synsnerven transection. Bruk av denne plassbesparende operative utvider modellens program utvalg, og gjør utforskning av sekundær skade mekanismer i RGCs på en ny måte.
Tidligere studier har vist at sekundære degenerering av netthinnen ganglieceller (RGCs) oppstår vanligvis i glaukom. Delvis synsnerven transection regnes som en nyttig og reproduserbar modell. Sammenlignet med andre synsnerven skade modeller brukes ofte for å vurdere sekundære degenerasjon, f.eks komplett synsnerven transection og synsnerven knuse modeller, er delvis synsnerven transection modellen bedre som den skiller primære fra sekundær degenerasjon i situ. Derfor, det fungerer som et utmerket verktøy for å vurdere sekundære degenerasjon. Denne studien beskriver en ny operative tilnærming av delvis synsnerven transection av direkte tilgang til området av synsnerven retrobulbar gjennom orbital laterale veggen av øyeeplet. Dessuten, presenterer vi en nydesignede, lavpris kirurgisk instrument hjelpe med transection. Som vist av representant resultatene i atskillende grensen av primære og sekundære områder, sikrer ny tilnærming og instrument høy effektivitet og stabilitet av modellen tilbyr tilstrekkelig plass for kirurgisk operasjon. Dette gjør i sin tur det enkelt å skille meningeal skjede og ophthalmica fartøy fra synsnerven før transection. En ekstra fordel er at denne plassbesparende operative forbedrer den etterforskere muligheten til å administrere narkotika, operatører eller Selektiv RGC tracers i stampe av delvis transected synsnerven, slik at utforskningen av mekanismene bak sekundær skade i RGCs, på en ny måte.
Sekundær degenerasjon skjer vanligvis i sentralnervesystemet (CNS) etter traumatisk skader, og følgende akutte og kroniske nevrodegenerative sykdommer. 1 , 2 , 3 , 4 , 5 død neurons og gliacellene som en tidlig konsekvens av primære patologisk hendelser som kalles primære degenerasjon, mens sekundære degenerasjon refererer til døden av neurons og gliacellene, som eller bare delvis ikke påvirkes av primær skade. Sekundær degenerasjon av RGCs er også antatt å skje i glaukom. 6 Yoles et al. 7 bekreftet at sekundære skade på RGCs oppstår i synsnerven skade modellen. De viste at nerveceller som axons ikke ble skadet etter en akutt skade vil til slutt degenerert på grunn av degenerative miljø produsert av skaden rundt disse axons. Denne sekundære degenerasjon påvirker nervecellene i en progressiv måte knyttet til alvorlighetsgraden av skader påført. Så langt, forblir mekanismene bak RGC skade i glaukom uklart, spesielt de relatert til sekundære skader som resulterer i utilstrekkelig klinisk behandling. 8 , 9 , 10 derfor er det nødvendig å utforske de underliggende mekanismene sekundære degenerasjon av RGCs under utviklingen av glaukom. 11 etableringen av dyr modeller av sekundær skade som kan kvantitativt vurdere størrelsen, distribusjon og mekanismen for sekundær degenerasjon av RGCs tiltrekker økende oppmerksomhet fra forskere som studerer sekundære skader på RGCs.
For å avklare dette problemet ble en rotte PONT modell etablert av Levkovitch-Verbin et al. 12 for å evaluere axonal skade indusert degenerasjon og død RGCs. Denne modellen er antatt å utgjøre et godt verktøy for å utforske mekanismer for sekundær degenerasjon og identifisere potensielle neuroprotective agenter. Apparatet brukes til å generere denne modellen av sekundær skade er en diamant kniv med en skala til mudderbunn kvantitativt ved å angi dybden av abscission gjennom ekstern knotten, for å fullføre en kvantitativ transection av synsnerven. Kirurgisk banen tilnærminger fra øyeeplet oppover eller temporal Konjunktiva. Under operative prosessen, kan netthinnen og optiske nervene bli påvirket av tang, som igjen kan føre til primære personskade. Enda viktigere, fordi det begrensede området i viste synsnerven er det vanskelig å skille meningeal skjede før snitt. Derfor er det mulig å skade ophthalmica fartøyene under delvis synsnerven transection, som resulterer i netthinnen iskemi og svikt i modellen. I tillegg diamantkniven er kostbart, og bruk synker tips skarpheten. Dette kan igjen påvirke dybden og virkningen av modellering.
Modell av sekundær degenerasjon av RGCs beskrevet i denne studien var oppnådd gjennom en ny operative tilnærming fra den laterale orbital veggen av øyeeplet. Denne romanen operative tilnærmingen åpner direkte retrobulbar synsnerven omkranset av orbital muskel kjeglen, unngå primære skader øyeeplet og synsnerven når nedover eller mot nasal lateral øyeeplet. Dette også øker for kirurgisk operasjon under opprettelse av modellen, og aktiverer meningeal skjede isolasjon før delvis transecting synsnerven. Det er viktig å merke at utilsiktet engasjement og skade på ophthalmica fartøy kan føre til svikt i modellen. Videre muliggjør modellen en oppfølging vurdering av transfekterte celler, narkotika og reagenser på Stabben i delvis transected synsnerven. De egenutviklede kirurgisk instrumentet er billig og kan brukes flere ganger, og dermed redusere kostnadene for modellering. Sekundær skade modellen av RGCs etablert av denne metoden ble vist å ha god reproduserbarhet og stabilitet.
Operative prosedyren
Det er noen punkter verdig varsel under modell oppbygging. I trinnet 4.2 skal kirurgisk bevegelsen utføres nøye for å unngå skade blodkar over subfascial muskelen. Spesielt når subkutan fascia i den ytre lateral canthus, skal skarp taggete tang brukes til å trekke oppover subkutan fascia på fascia overflaten loddrett; fascia bør kuttes med Vannas våren saks for å unngå skade orbital venen på den ytre canthus, som kan resultere i modellen feilen av overdreven blødning. Trinnet 4.3 har fordelen av potensielt hindre blødning når direkte fra blodkar. I skille orbital musklene i trinn 4.5, årsaken plukking skarp taggete tang men ikke Vannas er våren saks å unngå kontinuerlig blødning og blødning. Musklene skilles rett ut på begge sider i vinkelrett retning til huden fascia innsnitt; i mellomtiden er dyp musklene i bane strukket utover og perifert. Denne fremgangsmåten vil avdekke dypere deler av orbital hulrom, gir et større kirurgisk vindu og uhindret tilgang til vev overliggende synsnerven. I fremgangsmåtene ovenfor hvis blødning oppstår, trykket bør brukes med sterilt kirurgisk eller bomull vattpinner. Mindre blødning stopper etter noen sekunder av denne prosedyren. Formålet med trinn 4.6 er å lette oppfølging operasjoner for å enkelt fjerne noen fett og separat musklene i bane muskel kjegle å avsløre synsnerven retning synsnerven i orbital dybden.
De viktigste delene av gjeldende protokollen er trinn 5.1-5.6. Det er viktig ikke å skade blodkar rundt synsnerven hodet. Synsnerven bør være delvis transected minst 1,5-2.0 mm fra baksiden av øyet, å unngå skade arteria ophthalmica som trenger nerve innen 1 mm i øyet og leverer blod til indre netthinnen. Formålet om å kutte den laterale rectus er å oppnå bedre eksponering av synsnerven som den laterale rectus bred og åpenbart blokkerer visningen av synsnerven. I mellomtiden, for å unngå fjerning arteria ophthalmica som er forbundet med meningeal skjede (figur 5), er det nødvendig å skille og dissociate dura rundt synsnerven og undersøke vaskulær mønster av meningeal skjede, ved hjelp av pinsett forsiktig rotere skjede. Dessuten, skal et område uten blodkar identifiseres, slik at en langsgående kutt i meningeal skjede. Det er også nødvendig for å opprettholde en liten arbeidsavstand fra baksiden av øyet, å unngå delen av dura som er nært forbundet med ophthalmica arterien. Netthinnen er vanligvis gjennomsiktige blodkarene kan være klart avgrenset. Ved skadet retinal blodtilførsel, er netthinnen degenerert, fører til en melkeaktig hvit flocculent utseende. Glasslegemet Mysteriekammeret øyet og linsen blir vanligvis skyet, med redusert øyne størrelse over tid. I denne studien bekreftet preoperativ og postoperativ bilder av fundus ingen skader på fundus blod forsyning i modellen etter bruk trinnene ovenfor.
Videre kreves spesiell omsorg flere trinn av denne modellen. Når du bruker skarp-buet-taggete tang eller andre Kirurgiske instrumenter for å avsløre synsnerven, bør kirurgen unngå overdreven kraft, da dette kan skade synsnerven, øyeeplet eller ophthalmica arterie, primære skader og retinal ischemia. I tillegg bør blodkar rundt øyet ikke være skadet, for å unngå vedvarende blødning, som kan føre til svikt i modellering. SSAI brukt i dette eksperimentet krever delikat bruk. Når synsnerven plasseres i instrumentet sporet, må synsnerven og overflate monteres tett å sikre god konsistens og repeatability av hver dyremodell. Med praksis, kan full kirurgiske prosedyren fullføres innen 15-20 minutter per øye, etter at de opprinnelige posten kuttene er utført.
Wang et al. 19 publisert en lignende dyr modell av delvis synsnerven transection etableres ved hjelp av en synsnerven kvantitative amputator. De kirurgiske prosedyrene inkluderer: 1) skjære hverandre den ytre canthus, suspendere og fikse palpebral superior; 2) å utforske synsnerven, og transecting den bedre delen av synsnerven bruker amputator; og 3) Suturing conjunctiva og hud. Selv om den kirurgiske prosedyren var relativt enkel, oppstod følgende problemer under operasjonen. Selv om lateral canthus snitt kan utsette bestemt plass for operasjonen, var det en uunngåelig må hele tiden strekke øyeeplet slik at retrobulbar synsnerven skjede, spesielt når kirurgene ønsket å eksponere en lengre retrobulbar synsnerven skjede å lette videre skjede isolasjon; styrken for å strekke øyeeplet var større, som er sannsynlig å skade direkte trekkraft øyeeplet og synsnerven. Ingen spesiell oppmerksomhet ble betalt til blodårene som kan bli kuttet med synsnerven skjede, og skader på blodkar er sannsynlig føre til mislykket modell etablering. Viktigste prosedyrene for sekundær skade modellen beskrevet i denne hvitboken er: en ny operative tilnærming fra den laterale orbital veggen av øyeeplet til direkte tilgang retrobulbar synsnerven omgitt av orbital muskel kjeglen, unngå primære skader på øyeeplet og synsnerven, når nedover eller mot nasal laterale siden av øyeeplet. Denne nye operative tilnærmingen øker for kirurgisk operasjon under modellering og kan lett isolering av meningeal skjede, som er nært forbundet med ophthalmica arterien, før delvis transection av synsnerven. Delvis synsnerven transection ble utført med en egenutviklede kirurgisk instrument, som er kostnadseffektive og gjenbrukbare, redusere totalkostnadene for modellering. Rottas orbital strukturen er forskjellige fra andre pattedyr, med bane nærmest canthus og ingen benete struktur, men dekket med muskler. Kirurgisk tilnærming kan nå bakre del av øyeeplet uten behovet av orbital bein og periosteum. Gjennom streng preoperativ desinfeksjon og postoperativ antibiotika profylakse, var infeksjon, betennelse og ødem sterkt redusert.
Egenutviklede kirurgisk hjelperen Instrument
En rotte modell av delvis synsnerven transection ble etablert med egenutviklede kirurgisk assistent instrumentet, hvis hovedfunksjoner er som følger. Det kan hjelpe delvis kvantitative transection av synsnerven utsatt for riflet kanten, sørge for transection konsekvens mellom forskjellige dyr. Vi testet og bekreftet repeatability av modellen etablissement med SSAI. Den maksimale variasjonskoeffisienten var 1,85%, med en gjennomsnittlig verdi 0,67% ±0. 44%. 20 disse resultatene indikerer at SSAI kan brukes til å opprette delvis synsnerven transection modeller, med tilfredsstillende reproduserbarhet og FNiformity.
Riflet overflate bredde og design i halvsirkelen av sporets indre overflate kan ha en mer fast effekt på den optiske nerven og gjøre overflaten og synsnerven fest tettere, også redusere eksperimentelle feil og bivirkninger. Riflet kanten gir en bedre beskyttelse av synsnerven i sporet under operasjonen, som ikke vil skade den optiske nerven i sporet, uansett den kutter skarphet. En annen fordel riflet kant er forelsket skadeforebygging under synsnerven transection.
Det er egnet for opererer i dyp og smal plass. Den nye operative tilnærmingen utvidet, veien er fortsatt dyp og håndholdte pole og felles delen kan brukes til å plassere riflet hodet lett under synsnerven skjede utføre oppfølging operasjoner. Når apparatet brukes for operasjonen, kan en rekke cutters brukes transection, f.eks en 26 G pinne-spissen. Med en safir kirurgisk sonde kniv kan velge å unngå contusion og knuse skader forårsaket av saks. Groove overflater kan gjøres i forskjellige vertikalt dyp å fullføre varierende synsnerven kutte.
Sammenlignet med amputator av Wang har et al. SSAI en enklere struktur. I tillegg er kutte trinnet enklere med SSAI, med forbedret konsistens og repeatability av dyr modellen. Endelig er rekke verktøy anvendelig for skjæring med SSAI også større. I konklusjonen, kan SSAI, som gjør kvantitative og ensartet incisions i nerve, tjene som et effektivt instrument for å etablere rotte modeller for å vurdere synsnerven transection.
Kjennetegner rotte delvis synsnerven Transection modell
Delvis synsnerven transection modellen er nyttig å vurdere sekundære degenerasjon i RGCs. Potensielle fortjeneste av denne modellen er evnen å skille primære fra sekundær degenerasjon nøyaktig i situ, både i synsnerven og netthinnen. De sentrale og ventrale optiske nervene var mer utsatt for sekundær skade etter delvis transection (ca 1/3 til 1/2) av dorsal synsnerven (figur 6). I netthinnen, bør regionale plasseringen av primære og sekundære skader av RGCs være basert på topografien synsnerven tilsvarer retinal RGCs etter delvis transection. Hvis hele netthinnen av rotte er delt inn i dorsal (superior) og ventrale (underlegen) deler, er videregående og primære skader tilstede i begge deler. Imidlertid bør basert på forholdet mellom RGCs på netthinnen og synsnerven axon, RGC død i ventrale netthinnen hovedsakelig tilskrives sekundære skade (Figur 3). 12 , 22 , 23 fordelene med denne modellen inkluderer: enkel og lett å betjene instrument med standard prosedyrer; ingen innvirkning på ophthalmica skip; god reproduserbarhet og stabilitet. Denne teknikken kan brukes til å transfect RGCs fra denne plassbesparende operativ ved å bruke kort forstyrrende RNAs (siRNAs), plasmider, og viral vektorer av delvis synsnerven stubben; reagenser kan i tillegg plasseres på delvis synsnerven stump for selektiv behandling eller merking av RGCs.
Total, primære og sekundære skader av RGCs coexisted etter delvis synsnerven transection i denne dyr modellen, med en klar grense i netthinnen mellom de to skade. Selv om foreningen av synsnerven axons og RGC plassering på netthinnen må videre undersøkelser for en mer presis utmerkelsen, denne plassbesparende operative utvider hvilket program modellen og tillater forskere å utforske den mekanismer for sekundær skade i RGCs på en ny måte.
The authors have nothing to disclose.
Dette arbeidet ble støttet av Beijing Natural Science Foundation (7152038), grunnleggende forskning midlene sentral universitetene i Central Sør University (2016zzts162) og Science Foundation av Aier Eye Hospital forskergruppe (Grant nr. AF156D11). Til slutt, takk Fancheng Yan Yiping Xu for uvurderlig støtte gjennom årene.
Animal Aneathesia Ventilator System | MIDMARK | Matrx VMR | |
Isoflurane | RWD Life Science Co. | R510-22 | |
Surgical Microscope | Leica AG, Heerbrugg, Switzerland | M620 F20 | |
Tobramycin Eye ointment | Alcon | H20110312 | |
Fluorogold | Biotium | 80014 | |
Iris scissors | 66vision Co. | 54026 | |
Vannas spring scissor | 66vision Co. | 54137B | |
Sharp-serrated forceps/0.12mm toothed forceps | 66vision Co. | 53329A | |
Sharp-curved forceps | 66vision Co. | 53324A | |
Sapphire surgical probe | 66vision Co. | 50205TA | |
26G needle tip | Shandong Weigao Group Medical Polymer Co. | 3151474 | |
10 μl Hamilton Syringe | Hamilton Co. | 80030 | |
5-0 non-absorbable suture | Johnson & Johnson International Co. | W580 | |
Chlorhexidine | Sigma-Aldrich | 282227 | |
Stereotaxie apparatus | RWD Life Science Co. | 68026 | |
Retinal Imaging System | OptoProbe Ltd. | OPTO-RIS | |
RetCamII wide field imaging system | Clarity Medical Systems,Inc. | RetCamII | |
Fluorescence microscope | Leica Microsystems Inc. | DM6000 |