Partiell synnerven Transection råttor: en förebild som upprättats med en ny operativ metod att bedöma sekundära Degeneration av retinala ganglionceller

Summary

Sekundära degeneration av retinala ganglionceller (RGCs) uppstår vanligen i glaukom. Denna studie beskriver en innovativ operativ strategi för partiell synnerven transection. Användning av denna utrymmesbesparande operativ strategi sträcker sig modellens användningsområde och tillåter utforskning av sekundär skada mekanismer i RGCs på ett nytt sätt.

Abstract

Tidigare studier har visat att sekundära degeneration av retinala ganglionceller (RGCs) förekommer vanligen i glaukom. Partiell synnerven transection anses vara en användbar och reproducerbara modell. Jämfört med andra synnerven skada modeller används vanligen för bedömning av sekundär degeneration, e.g. komplett synnerven transection och synnerven crush modeller, är partiell synnerven transection modell överlägsen som det skiljer primära från sekundära degeneration i situ. Därför, den fungerar som ett utmärkt verktyg för att utvärdera sekundära degeneration. Denna studie beskriver en ny operativ metod av partiell synnerven transection genom direkt tillgång till området av retrobulbär synnerven genom omloppsbanor laterala väggen av ögongloben. Dessutom presenterar vi en nydesignade, låg kostnad kirurgiska instrument för att hjälpa till med transection. Vilket framgår av de representativa resultat skilja gränsen för primär och sekundär skada områden, garanterar den nya instrument och hög effektivitet och stabilitet av modellen för genom att ge tillräckligt utrymme för kirurgisk operation. Detta gör i sin tur att det är lätt att skilja på meningeal slida och oftalmologiska fartyg från synnerven innan transection. En ytterligare fördel är att denna utrymmesbesparande operativ strategi förbättrar utredarnas förmåga att administrera läkemedel, bärare eller selektiv RGC spårämnen till stubben av delvis transected synnerven, möjliggör utforskandet av mekanismerna bakom sekundär skada i RGCs, på ett nytt sätt.

Introduction

Sekundära degeneration uppstår vanligen i det centrala nervsystemet (CNS) efter traumatiska skador och följande akuta och kroniska neurodegenerativa sjukdomar. ^{1 , 2 , 3 , 4 , 5} död av nervceller och stödjeceller som en tidig följd av primära patologiska händelser som kallas primär degeneration, medan sekundär degeneration refererar till död av nervceller och stödjeceller, som inte eller bara delvis påverkas av primär skador. Sekundära degeneration av RGCs är också tros uppstå i glaukom. ⁶ Yoles o.a. ⁷ bekräftat att sekundära skadan av RGCs uppstår i synnerven skada modellen. De visade att nervceller vars axoner inte skadades efter en akut skada kommer så småningom urartar på grund av degenerativa miljö producerad av den skada som omger dessa axoner. Denna sekundära degeneration drabbar nervceller i en progressiv mode relaterade till svårighetsgraden av skadorna. Hittills har förblir mekanismerna bakom RGC skador i glaukom oklart, särskilt sådana som anknyter till sekundär skada, vilket resulterar i otillräcklig klinisk behandling. ^{8 , 9 , 10} därför det är nödvändigt att undersöka de bakomliggande mekanismerna av sekundära degeneration av RGCs under utvecklingen av glaukom. ¹¹ fastställande av djurmodeller för sekundära skador som kan kvantitativt bedöma storlek, distribution och mekanism av sekundära degeneration av RGCs lockar allt större uppmärksamhet från forskare som studerar sekundär skada av RGCs.

För att klargöra denna fråga, grundades en råtta PONT modell av Levkovitch-Verbin et al. ¹² att utvärdera axonal skada inducerad degeneration och döden av RGCs. Denna modell tros utgöra ett bra verktyg för att utforska mekanismerna av sekundära degeneration och identifiera potentiella nervskyddande agenter. Instrumentet används för att generera denna modell av sekundär skada är en diamond kniv med en skala till transekt kvantitativt genom att ange djupet av abscission genom ratten ratten, för att slutföra en kvantitativ transection av synnerven. Kirurgisk väg närmar sig från ögongloben uppåt eller temporal bindhinnan. Under den operativa processen, kan näthinnan och synnerverna påverkas av styrkan av pincetten, som i sin tur kan orsaka primär skada. Viktigare, på grund av det begränsade utrymmet av exponerade synnerven är det svårt att skilja den meningeal slidan innan snittet. Därför är det möjligt att skada de oftalmologiska fartyg under partiell synnerven transection, vilket resulterar i retinal ischemi och misslyckandet av modellen. Dessutom i diamantkniven är kostsamt, och varje användning minskar tip skärpan. Detta kan i sin tur påverka djup och effekten av modellering.

Modellen av sekundära degeneration av RGCs beskrivs i denna studie erhölls genom en ny operativ strategi från den laterala orbital väggen i ögongloben. Denna roman operativ strategi går direkt till retrobulbär synnerven omgiven av orbital muskel konen, undvika primära skador på ögongloben och synnerven när du drar nedåt eller mot den nasala laterala sidan av ögongloben. Detta också ökar utrymmet av kirurgisk operation under modell etablering, och gör meningeal slida isolering innan delvis transecting synnerven. Det är viktigt att notera att den oavsiktlig inblandning och skadan av oftalmologiska fartyg kan leda till fel i modellen. Modellen möjliggör dessutom en uppföljande bedömning av transfekterade celler, droger och reagenser på stubben av delvis transected synnerven. Egendesignade kirurgiska instrumentet kan är billigt och användas flera gånger, vilket minskar kostnaden för modellering. Sekundär skada modellen för RGCs som inrättats genom denna metod visade sig ha bra reproducerbarhet och stabilitet.

Protocol

förfaranden som omfattar animaliska ämnen godkändes av institutionella djuret och användning kommittén (IACUC) det kapital Medical University. Alla kirurgiska instrument och lösningar var steriliserad före operationen att begränsa mikrobiell infektion. Obs: kirurgiska protokollet ingår fem delar, nämligen anestesi, kirurgisk metod, synnerven utvärdering, stängning och återhämtning. För att bistå med delvis kvantitativa transection av synnerven, utformades en ny, låg kostnad kirurgiskt instrument. Alla förfaranden genomfördes efter etiska regler och operationsteknik. 1. kirurgiteknik genomföra experiment med hjälp av aseptisk teknik, protokoll för användning av djur bör vara institution specifika. Sterilize instrument och material (lösningar, testsubstanser, spårämnen, nålar, etc.) kommer i kontakt med levande vävnader för att förhindra infektion och negativa effekter på djurens välbefinnande samt potentiella negativa effekter på studien . 2. Anestesi Anesthetize SD råttor med hjälp av en veterinär isofluran spridare system. Använda medicinskt syre med en hastighet på 1 L/min för att förånga isofluran gasen. Placera djuret i rutan bifogade anestesi och kör isofluran vid en koncentration på 4,5% tills långsam andning och djur sedering. Växla gasflödet till gasmask kvarstad och placera djuret på tabellen drift. Lägre isofluran koncentrationen till 2% och övervaka anestesi. Större djur (> 300 g) kan kräva en högre koncentration av isofluran. Övervaka narkos under operationen med isofluran dosering justeras därefter. Ständigt utvärdera djup och hastighet av andning, och utföra tå nypa utvärdering varje 5 min, för att säkerställa frånvaro av djup smärta. När operationen är klar, Stäng av isofluran och låt djuret andas syre i flera minuter före borttagning från tabellen drift. Upprätthålla kroppstemperaturen genom täcker djuret med en kirurgisk filt använda en reglerad värme filt under operation. 3. Egendesignade kirurgisk assistent Instrument (SSAI) Använd en SSAI tillverkade av rostfritt stål, och främst består av en handhållen stolpe (längd, 100 mm, diameter, 9 mm) och ett räfflat huvud ( figur 1). Räfflat huvud räfflad yta är halvcirkelformad, med vertikalt djup, bredd och längd på 200 µm, 500 µm och 1000 µm, respektive. Mellan de två delarna finns det ett samläsningstillfälle med en längd av 50 mm. Räfflat huvud ' s edge är 300 µm breda. Obs: Den räfflade ytan gör stabiliseringen av den ventrala synnerven för transection. Dorsala synnerven är utsatt på utsidan av spåret när den ventral sidan av synnerven fastställer inom det; under tiden kan den dorsala synnerven som utsätts för den räfflade kanten vara transected när vertikala styckningen utförs. Ventrala synnerven som inom den räfflade ytan skyddas av räfflat huvud ' s edge. Uppnå primära skada i RGCs motsvarar kvantitativt transected synnerven axoner (ryggsidan), medan sekundärt skador skulle utföras i RGCs motsvarar untransected synnerven axoner (ventrala sida) utan direkt skada. 4. Kirurgisk metod plats till höger om råttan uppåt på det kirurgiska bordet med huvud inför kirurgen. Justera rätt bana i mitten av kirurgiska synfältet. Ren sedan, snittet området flera gånger längs de laterala Cantus till externa akustiska foramen av just orbital huden, tillämpa 0,5% klorhexidin i 75% etanol. Ta bort pälsen mellan de laterala Cantus till externa akustiska foramen med iris sax. Gör en huden snitt med iris sax längs de laterala Cantus till externa akustiska foramen med en längd på 0,5 till 1 cm. Sedan, nypa den fascia och dra uppåt för att skapa en triangulär kil med 0,12 mm tandad tång. Infoga det lägsta bladet Vännäs våren sax i området snitt och uppskuren fascian i samma skeva riktning. Cut fascia med Vännäs våren sax och exponera den orbital ven. Använd skarpa sågtandade pincett klämma sidorna av orbital ven och trubbig öppna båda sidor av snittet. Placera den orbital ven i kirurgiska riktning av orbital muskel ytan, som är positionerade för att underlätta uppföljning drift och att undvika kirurgi relaterad blödning av orbital ven. Använd iris sax för att klippa rätt laterala Cantus apart längs linjen för snitt att helt avslöja synfältet för trubbig dissektion av orbital muskler under Följ upp Fortsätt att klämma mappen av subfascial orbital muskeln och trubbig separat vertikalt i riktning mot hud och fascia snitt. Separat längs sidorna gradvis för att nå orbital djup, tills uppkomsten av orbital fettvävnad. Efter exponering av orbital fettvävnad, ändra råtta huvud riktning från inför kirurgen vertikalt till höger sida av kirurgen. Under tiden hålla område ständigt fuktig med kirurgisk eller bomullspinnar som innehåller steril fosfatbuffrad Koksaltlösning. Detta förfarande säkerställer en tydlig vision av operationsområdet, samtidigt hålla vävnader fuktig och mjuk. 5. Åtkomst till synnerven avskurna orbital fettvävnad som täcker omloppsbanor muskel konen runt synnerven i omloppsbanor kaviteten. Detta säkerställer en bättre exponering av den lämpliga kirurgiska metoden. Håll resektion av fettvävnad begränsad för att undvika ihållande blödning. Cut fettvävnad, utsätta de laterala rectus. Klämma den laterala rectus utåt, och sedan klippa det med Vännäs våren sax. Om fettvävnad förblir under den laterala rectus, dra upp fettet överliggande synnerven med 0,12 mm tandad tång och skär den med Vännäs våren sax. Obs: Vid denna tid, den vävnad slidan runt den optiska nerven ska synas. Fortsätt att separera den vävnad slidan längs riktningen av synnerven i orbital djup, tills total exponering av synnerven. Håll området rent genom att använda kirurgiska kompresser till rena små mängder blod som uppstår från vävnad borttagning. Obs: Nu, synnerven bör synas. För att komma åt den, ta bort den meningeal slida som omger nerven utan att skada den oftalmologiska artären. Försiktigt rotera slidan för att undersöka det vaskulära mönstret av dura med hög förstoring under en löpande Mikroskop. Identifiera ett område saknar blodkärl och utföra ett längsgående snitt på dura. 13 rip slida parallellt med riktningen av synnerven med 26G nålens spets eller knifepoint av safir kirurgisk sond försiktigt, undvika skador på kärlsystemet med laterala nedskärningar. Obs: Den enda överblivna täcker nerven bör vara den spindelvävshinnan membraNe, som är mycket tunn och genomskinlig. Liknande steg 5.2, rippa spindelvävshinnan membranet försiktigt med en 26G nål spets eller knifepoint av safir kirurgisk sond, parallellt med riktningen av synnerven. 13 lay synnerven inom instrument spåret mjukt och försiktigt, vilket resulterar i dorsala synnerven att vara något högre än räfflat huvud kanten. Vid denna tid, transekt dorsala synnerven ovanför kanten av räfflat huvud plattformen med 26G nål spets eller knifepoint av safir kirurgisk sond att slutföra partiell synnerven transection. 6. Stängning och återhämtning flytta instrumentet lite djupare mot vertikalt riktningen av synnerven till gratis den senare. Ta sedan bort räfflad huvudet av instrumentet varsamt. Försök inte att repa de okulära musklerna eller andra vävnader för att undvika extra skada. Stubben av partiell synnerven transection kan observeras. Ersätta den laterala rectus, fascia och andra omgivande vävnader i ögat till sina ursprungliga positioner. Sedan suturera muskeln och hudlagren i omloppsbana i sekvens. Om blödning kvarstår, försiktigt fylla med en medicinsk bomullstuss innan du stänger såret och upprätthålla detta under en tid. Tillämpa antibiotisk salva på såret att förhindra infektion. Turn off isofluran källan och tillåter djuret att andas syre i flera minuter. Håller på råtta återupplivning, förbereda värmeisolering med en uppvärmd matta, eller täcka buren ytan med torr stoppning. Täcka djuren med filtar, att säkerställa råtta luftvägarna patency under återhämtningsprocessen. Hus djur individuellt efter operation. Administrera postoperativa analgetika enligt de riktlinjer som fastställs av institutionella djurvård myndigheterna. Noggrant övervaka djur efter kirurgi.

Representative Results

Om du vill kontrollera om fastställande av en sekundär skada modell med den nya operativa metoden använder SSAI (figur 2A), var RGCs retrogradely märkt omedelbart efter modell. Syftet med detta förfarande var att etikett RGCs retrogradely genom att injicera ett neural tracer färgämne (3% fluorophore (t.ex., Fluorogold) i steril fosfat buffert saltlösning) i den superior colliculus (figur 2B). Detta tillvägagångssätt ger reproducerbara märkning av livskraftiga RGCs med lite variation. 14 , 15 , 16 , 17 , 18 färgämnet retrogradely kommer att tas upp av RGCs i näthinnan och utgör en markör för levande RGCs, med den axoner som inte transected i höger öga. Under tiden RGCs motsvarar delvis transected synnerven axoner i höger öga inte kunde märkas med tracer färgämne (figur 2 c). Som en kontroll öga, vänster öga utan drift, RGCs längs den optiska nerven av näthinnan var alla märkta med fluorescerande guld färgämnet i en retrograd sätt från den superior colliculus (figur 2D). Sju dagar efter partiell synnerven transection och retrograd märkning av RGCs, var näthinnor skördas, fast, tillplattad och monterade. De märkta RGCs var avbildade i fluorescerande Mikroskop i definierade regioner i näthinnan. Resultaten av fluorescens-märkt RGCs med eller utan partiell synnerven transection visas i figur 3. Endast RGCs i det högra näthinnan som motsvarar den untransected delen av den optiska nerven var märkt med fluorescerande guld, och en tydlig gräns för omärkta och märkta RGCs kunde vara visualiseras (figur 3A, figur 3B), Visar delvis transaktionen av synnerven. Som en kontroll öga, alla RGCs av den vänstra öga näthinna visade fluorescensen (figur 3 c, figur 3D). För att bedöma huruvida vaskulatur runt synnervspapillen och oftalmologiska artär som levererar blod till entoretina skadade och påverkades under operationen, höger öga fundus fotograferades före och efter operation. Bilderna visade blodtillförsel till höger öga (operativa öga) före och 1 timme efter operationen. Blodet i artärerna var tillräcklig. Utan hinder av ven observerades. Dessa resultat visade att det fanns inga skador på blod leverans systemet under operationen (figur 4A, figur 4B). Den sekundära degeneration modellen för RGCs fastställdes därför framgångsrikt. Figur 1 : Fotografier av egendesignade kirurgisk assistent instrument, SSAI. (A) en panoramavy av kirurgiska instrument, med två huvuddelar, inklusive en handhållen stolpe och ett räfflat huvud. Mellan dem finns det ett samläsningstillfälle med en längd av 50 mm. Den handhållna Polen längd är 100 mm och den handhållna Polen diameter är 9 mm. (B) en funktion av SSAI räffla. Räfflat huvud räfflad yta är semi cirkuläret, som gör att synnerven till låg inom det, att vara stabiliserad för transection. Den räfflade ytan är med 200 µm vertikala djup och en bredd på 500 µm och en längd på 1000 µm. Bredden på kanten av räfflat huvud är 300 µm. vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra. Figur 2 : Schematisk bild av RGC märkning på näthinnan efter partiell transection av rätt synnerven med instrumentet egendesignade kirurgisk assistent (SSAI) och retrogradely märkning av superior colliculus med fluorophore. (A) kirurgisk synpunkt delvis rätt synnerven transection hos råttor med instrumentet egendesignade kirurgisk assistent (SSAI). (B) efter modellering, RGCs var märkt retrogradely genom att injicera ett neural tracer färgämne (gul färg, 3% fluorophore i sterila fosfat buffert saltlösning) i den superior colliculus i hjärnan. Eftersom axoner av RGCs bor i den superior colliculus, tracer färgämnet tas upp av RGCs retrogradely och utgör en markör för levande celler. Tvärgående avsnittet i figuren representerar ett tvärsnitt av synnerven. OD, opererade ögat; OS, kontroll öga utan operation. (C), var endast de RGCs som motsvarar den untransected delen av synnerven märkt med fluorophore. Blå representerar sammanhängande ventrala synnerverna och de motsvarande RGCs på näthinnan; röd återspeglar delvis transected dorsala synnerverna och de motsvarande RGCs på näthinnan. (D) retinal RGCs av vänster öga (kontroll öga) utan det kirurgiska ingreppet var alla märkt av färgämnet. Rygg- och ventrala synnerverna var alla märkt av färgämnet samt. Klicka här för att se en större version av denna siffra. Figur 3 : Hela näthinnan epifluorescence micrographs av fluorophore märkt RGCs 7 dagar efter att den partiella synnerven transection modell och retrograd märkning av den superior colliculus. De motsvarande Schematiskt diagram över Fluorogold målat RGC områden på näthinnan presenteras också. (A) och (C) representerar de Schematiskt diagram över RGCs i näthinnan av rätten (operativ) och vänster (kontroll) ögon efter märkning med fluorophore, respektive. Gult indikerar området märkt med den fluorescerande guld färgen. Näthinnan är uppdelad i dorsala och ventrala centrala delar. (B) och (D) representerar hela retinal epifluorescence micrographs erhålls i fluorescens Mikroskop; gul representerar området i RGCs märkt med fluorophore. I den kirurgiska öga (höger öga) visas i B, representerar regionen omärkt området av RGCs motsvarar synnerven som är delvis transected, huvudsakligen på ryggsidan av näthinnan. Regionen märkt av fluorescerande guld färgämnet är området av RGCs motsvarar synnerven som inte är transected och huvudsakligen koncentrerade till centrala och ventrala sidorna av näthinnan. BounDarys mellan områdena omärkt och märkta RGCs är klart. Primär degeneration av RGC organ skulle begränsas till de dorsala retina och alla förlust av RGC organ i de central- och ventrala näthinnor kunde hänföras till sekundära degeneration. (D) hela retinal photomicrograph av vänster öga efter märkning av RGCs med fluorophore. RGCs av vänster kontroll ögat utan kirurgiskt ingrepp var helt målat av fluorophore. Skala barer = 500 µm. vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra. Figur 4 : Preoperativa och postoperativa bilder av fundus i höger öga erhålls genom Fundus kamera. (A) bild av ögonbotten före höger öga kirurgi hos råttor visar bra blodtillförsel av fundus, arteriell fyllning, utan venöst återflöde eller obstruktion, indikerar en bra retinal blod försörjningssystem. (B) bild av fundus i höger öga 1 timme efter kirurgi. Jämfört med den preoperativa bilden av fundus, observerades inga signifikanta förändringar i näthinnans blodtillförsel, som visar att blod leverans systemet av ögongloben inte påverkades under processen för modellering. Klicka här för att se en större version av denna siffra. Figur 5 : Fotografier av retrobulbär synnerven och oftalmologiska artär ligger på meningeal slida, fångas genom den kirurgiska metoden. Efter helt bort riktade längden av synnerven, var oftalmologiska artär (pilspets) samtidig med meningeal slida av synnerven utsatt och parallell till synnerven. Skala barer = 500 µm. vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra. Figur 6 : Schematisk bild av primära och sekundära degeneration platser i synnerven. Partiella snitt av synnerven uppnåddes med hjälp av egendesignade kirurgisk assistent instrumentet (pilspets). Axoner i direkt skadade webbplatser (dorsala skärande plats av synnerven i avsnittet tvärgående i grått) genomgå primär degeneration, medan de i indirekt skadat platser (central- och ventrala områden av synnerven i avsnittet tvärgående i gult) genomgå sekundär degeneration. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Discussion

Operativt förfarande

Det finns vissa punkter värdig underrättelse i färd med att modellera konstruktion. I steg 4,2, bör kirurgiska rörelsen utföras noggrant för att undvika att skada vaskulatur ovan subfascial muskeln. Särskilt, när du klipper den subkutana fascian i det yttre laterala Cantus, kan sharp-tandad tång användas att dra uppåt subkutana fascian på fascia ytan vertikalt; fascian bör skäras med Vännäs våren sax för att undvika skador till orbital ven på de yttersta Cantus, vilket kan resultera i modell misslyckande av kraftig blödning. Steg 4,3 har fördelen av potentiellt hindrar blödning när du tar direkt bort från blodkärlen. I att separera orbital muskler i steg 4,5, anledningen till plockning sharp-tandad tång men inte Vännäs är våren sax att undvika kontinuerlig blödning och blödning. Musklerna är rakt på sak separerade på båda sidor i vinkelrät riktning till huden fascia snittet; under tiden är de djupa musklerna i omloppsbana sträckta utåt och perifert. Detta förfarande kommer att avslöja djupare delar av omloppsbanor kaviteten, som ger ett större kirurgiska fönster och tillåta obehindrat tillträde till vävnader överliggande synnerven. I ovanstående regler, om blödning uppstår, trycket bör tillämpas med hjälp av sterila kirurgiska eller bomullspinnar. Mindre blödning stannar efter några sekunder av detta förfarande. Syftet med steg 4,6 är att underlätta uppföljning för att enkelt ta bort lite fett och separata muskler i omloppsbana muskel konen att exponera synnerven längs riktningen av synnerven i orbital djupet.

De mest kritiska delarna av det nuvarande protokollet är steg 5.1-5.6. Det är viktigt att inte skada i blodkärlen runt synnervspapillen. Synnerven bör vara delvis transected på minst 1,5-2,0 mm från baksidan av ögat, för att undvika skada på den oftalmologiska artär som penetrerar nerven inom 1 mm av ögat och levererar blod till inre näthinnan. Syftet med skära den laterala rectus är att uppnå bättre exponering av synnerven som den laterala rectus är bred och uppenbarligen blockerar vyn av synnerven. Samtidigt för att undvika att ta bort den oftalmologiska artär som associeras med den meningeal slidan (figur 5), är det nödvändigt att separera och separera dura runt synnerven och undersöka det vaskulära mönstret av meningeal slida, med pincett för att försiktigt rotera slidan. Dessutom bör ett område saknar blodkärl identifieras, så att ett längsgående snitt i meningeal skidan. Det är också nödvändigt att bibehålla ett litet avstånd från baksidan av ögat, att undvika portion av dura som är nära förknippad med oftalmologiska artär. Näthinnan är normalt öppet och blodkärl kan vara klart avgränsade. Vid skadade retinal blodtillförsel, är näthinnan degenererat, vilket leder till en mjölkvit flockig utseende. Glaskroppen kammaren i ögat och linsen blir vanligtvis grumlig samt, med minskad eye storlek över tid. I denna studie bekräftade preoperativa och postoperativa bilder av fundus ingen skada att fundus blodtillförseln i modellen efter tillämpning av ovanstående steg.

Dessutom krävs särskild omsorg i flera steg av denna modell. När du använder sharp-böjd-tandad tång eller andra kirurgiska instrument för att exponera synnerven, bör kirurgen undvika överdriven kraft, eftersom det kan skada synnerven, ögongloben eller oftalmologiska artär, vilket resulterar i primära skador och retinal ischemi. Dessutom bör blodkärlen kring ögat inte skadas, för att undvika ihållande blödning, vilket kan leda till fel i modellering. Den SSAI som används i detta experiment kräver känsliga användning. När synnerven placeras inom instrument spåret, behöver synnerven och räfflad yta monteras tätt att säkerställa bra konsistens och repeterbarhet av varje djurmodell. Med praktiken kan hela ingreppet slutföras inom 15-20 minuter per öga, efter initial transaktion nedskärningarna har gjorts.

Wang et al. ¹⁹ publicerade en liknande djurmodell av partiell synnerven transection etablerade använder en synnerven kvantitativa Amputeraren. De kirurgiska ingrepp innehåller: 1) skär isär de yttersta Cantus, tillfälligt upphävande och fastställande den palpebrala överlägsen; (2) att utforska synnerven, och transecting den överlägsna delen av synnerven med Amputeraren; och 3) suturering av bindhinnan och hud. Även om det kirurgiska ingreppet var relativt enkla, uppstod de följande problem under operationen. Även om laterala Cantus snitt kan exponera vissa utrymme för drift, fanns det ett oundvikligt behov att hela tiden sträcka ögongloben för att exponera den retrobulbär synnerv slidan, särskilt när kirurgerna önskas att exponera en längre retrobulbär synnerven slida att underlätta ytterligare slida isolering; kraft för stretching ögongloben var större, som sannolikt kommer att skada direkt dragning av ögongloben och synnerven. Ingen särskild uppmärksamhet ägnades åt blodkärl som kan skäras tillsammans med synnerven slida, och skador på blodkärl är sannolikt att leda till misslyckade modell etablering. De huvudsakliga förfarandena för sekundära skador modell som beskrivs i detta dokument är: en ny operativ strategi från den laterala orbital väggen i ögongloben till direkt tillgång retrobulbär synnerven omgiven av orbital muskel konen, undvika primär skada till den ögongloben och synnerven, när du drar nedåt eller mot den nasala laterala sidan av ögongloben. Denna nya operativa strategi ökar utrymmet av kirurgisk operation under modellering, och möjliggör lätt isolering av meningeal slida, som är nära förknippad med den oftalmologiska artären, innan partiell transection av synnerven. Partiell synnerven transection utfördes med ett egendesignade kirurgiska instrument, som är kostnadseffektiv och återanvändbara, minska totalkostnaden för modellering. Råttans orbital struktur är annorlunda från andra däggdjur, med banan som är närmast Cantus och ingen benstrukturen, men täckt med muskler. Den kirurgiska metoden kunde nå den bakre delen av ögongloben utan att behöva förstöra den orbital ben och periostet. Genom strikt preoperativ desinfektion och postoperativ antibiotikaprofylax, var infektion, inflammation och ödem kraftigt reducerad.

Egendesignade kirurgisk assistent Instrument

En råtta modell av partiell synnerven transection fastställdes med hjälp av egendesignade kirurgisk assistent instrumentet, vars huvuddrag är följande. Det kan hjälpa delvis kvantitativa transection av synnerven utsätts för räfflade kanten, också samstämmighet transection bland olika djur. Vi testade och verifierade repeterbarheten av modell anläggning med SSAI. Den maximala variationskoefficienten var 1,85%, med ett genomsnittligt värde 0,67% ±0. 44%. ²⁰ dessa resultat indikerar att SSAI kunde användas att upprätta partiella synnerven transection modeller, med tillfredsställande reproducerbarhet och FNiformity.

Räfflad ytans bredd och utformningen av sikthalvcirkeln spårets inre ytan kan ha en mer fast effekt på synnerven och göra den räfflade ytan och synnerven bifoga mer tätt, också minskar experimentella fel och biverkningar. Den räfflade kanten ger ett bättre skydd av synnerven i spåret under operationen, som inte kommer att skada synnerven i spåret, oavsett fräsens skärpa. En annan fördel med den räfflade kanten är crush skadeförebyggande under synnerven transection.

Det är lämpligt för drift i djupa och smala utrymme. Även om den nya operativa metoden utökats, vägen är fortfarande djupt och handhållna pole och gemensamma avsnitt kan användas för att placera räfflad huvudet lätt under synnerven slida att utföra uppföljande åtgärder. När instrumentet används för drift, kan ett brett utbud av fräsar användas för transection, e.g. en 26 G nålspetsen. Även en safir kirurgisk sond kniv kan väljas att undvika kontusion och krossa skador orsakade av sax. Groove ytor kan göras i olika vertikala djup att slutföra olika grader av synnerven skärning.

Jämfört med Amputeraren Wang har et al. SSAI en enklare struktur. Det skärande steget är dessutom bekvämare med SSAI, med förbättrad konsekvens och repeterbarhet av animaliskt modellen. Verktyg som är tillämpliga för kapning med SSAI är slutligen också bredare. Sammanfattningsvis kan SSAI, vilket gör kvantitativa och enhetlig snitt av nerv, tjäna som ett effektivt instrument för att fastställa råtta modeller för bedömning av synnerven transection.

Egenskaper hos råtta partiell synnerven Transection modellen

Partiell synnerven transection modellen är användbart för att bedöma sekundära degeneration i RGCs. Den potentiella fördelen att denna modell är förmågan att separera primära från sekundära degeneration korrekt i situ, både i synnerven och näthinnan. De centrala och ventrala synnerverna var mer känsliga för sekundär skada efter partiell transection (ca 1/3 till 1/2) av dorsala synnerven (figur 6). I näthinnan, bör den regionala läge av primära och sekundära skador av RGCs baseras på synnerven motsvarande retinala RGCs efter partiell transection topografi. Om hela näthinnan av råtta är indelat i dorsala (superior) och ventrala (sämre) delar, är sekundära och primära skador närvarande i båda delarna. Men bör baserat på förhållandet mellan RGCs på näthinnan och synnerven axon, RGC död i ventrala näthinnan främst hänföras till sekundär skada (figur 3). ^{12 , 22 , 23} fördelarna med denna modell inkludera: enkel och lätt att använda instrumentet med standardförfaranden; ingen effekt på oftalmologiska fartyg. Bra reproducerbarhet och stabilitet. Denna teknik kan användas för att transfect RGCs från denna utrymmesbesparande operativ strategi genom att tillämpa kort störande RNAs (siRNAs), plasmider och virala vektorer på partiell synnerven stubbe; Dessutom kunde reagenser placeras på partiell synnerven stubben för selektiv behandling eller märkning av RGCs.

Övergripande, primära och sekundära skador av RGCs samexisterat efter partiell synnerven transection i denna djurmodell, med en tydlig gräns i näthinnan mellan två skada typer. Även om associering av RGC läge på näthinnan och synnerven axoner behöver ytterligare utredning för en mer exakt åtskillnad, denna utrymmesbesparande operativ strategi utökar användningsområdet av modellen och tillåter forskare att utforska den mekanismer för sekundära skador i RGCs på ett nytt sätt.

Materials

Animal Aneathesia Ventilator System	MIDMARK	Matrx VMR
Isoflurane	RWD Life Science Co.	R510-22
Surgical Microscope	Leica AG, Heerbrugg, Switzerland	M620 F20
Tobramycin Eye ointment	Alcon	H20110312
Fluorogold	Biotium	80014
Iris scissors	66vision Co.	54026
Vannas spring scissor	66vision Co.	54137B
Sharp-serrated forceps/0.12mm toothed forceps	66vision Co.	53329A
Sharp-curved forceps	66vision Co.	53324A
Sapphire surgical probe	66vision Co.	50205TA
26G needle tip	Shandong Weigao Group Medical Polymer Co.	3151474
10 μl Hamilton Syringe	Hamilton Co.	80030
5-0 non-absorbable suture	Johnson & Johnson International Co.	W580
Chlorhexidine	Sigma-Aldrich	282227
Stereotaxie apparatus	RWD Life Science Co.	68026
Retinal Imaging System	OptoProbe Ltd.	OPTO-RIS
RetCamII wide field imaging system	Clarity Medical Systems,Inc.	RetCamII
Fluorescence microscope	Leica Microsystems Inc.	DM6000