I Vivo Sporing av menneskelig liggende under Adipose-avledet Mesenchymal stamceller i en rotte kneet slitasjegikt modell med fluorescerende lipofile membran fargestoff
Summary
Denne protokollen beskriver en effektiv måte å overvåke celle utholdenhet og biodistribution av menneskelig liggende under adipose-avledet mesenchymal stamceller (haMSCs) av langt rødt fluorescens merking i en rotte kneet slitasjegikt (KOA) modell via intra articular (IA) injeksjon.
Abstract
For å støtte klinisk anvendelse av menneskelig liggende under adipose-avledet mesenchymal stamceller (haMSC) terapi for kneet slitasjegikt (KOA), undersøkte vi effekten av cellen utholdenhet og biodistribution av haMSCs i dyremodeller. Vi viste en metode for å merke cellen membran av haMSCs med lipofile fluorescerende farge. Deretter var intra articular injeksjon av merket cellene i rotter med kirurgisk indusert KOA overvåket dynamisk av en i vivo imaging system. Vi ansatt den lipofile carbocyanines gjorde (DilC18 (5)), en langt rødt fluorescerende Dil (dialkylcarbocyanines) analog, som benyttet en rød laser for å unngå magnetisering av naturlige grønne autofluorescence fra omkringliggende vev. Videre de rød-skiftet utslipp spektra av tillatt dype vev bildebehandling i levende dyr og merking prosedyren forårsaket ingen cytotoksiske effekter eller funksjonelle skade haMSCs. Denne tilnærmingen har vist seg å være en effektiv oppfølgingsmetode for haMSCs i en rotte KOA modell. Anvendelsen av denne metoden kan også brukes til å bestemme optimal administrasjon ruten og dosering av MSCs fra andre kilder i pre kliniske studier.
Introduction
Kneet slitasjegikt (KOA) er en degenerativ lidelse som følge av articular brusk tap og progressiv betennelse, som har blitt en stor kronisk sykdom i eldre rundt verden1. Imidlertid kan gjeldende terapi bruker anti-inflammatoriske legemidler, fysisk kosttilskudd og kirurgiske prosedyrer bare gi midlertidig lindring for symptomatisk smerte2.
Menneskelige liggende under adipose-avledet mesenchymal stamceller (haMSCs) har blitt et lovende regenerativ middel for kneet slitasjegikt, på grunn av deres multipotent differensiering potensial for brusk regenerasjon og immunmodulerende egenskaper3, 4. Sammenlignet med farmakologiske ruter å undersøke mekanismer for handlingen vivo, er sporing live haMSCs i små KOA dyremodeller for tiden lærerikt å etablere begrunnelse for og gjennomførbarhet av haMSC terapi før klinisk anvendelse. For prekliniske testing, destabilizes mediale meniscectomy (MM) mekanisk belastningen av felles å indusere KOA i rotter, som gir en relativt mulig modell konsekvent reproduserbarhet5. Utbruddet av KOA indusert av MM er tidligere enn transection i fremre korsbånd alene eller kombinert med delvis mediale meniscectomy6. Derfor vurderes ofte langsiktige samspillet mellom injisert haMSCs med patologisk microenvironment av KOA i rotter indusert av MM7,8.
Selv om terapeutiske effekten av haMSCs har blitt mye rapportert, relevant kunnskap på er faste i vivo implantert haMSCs via intra articular (IA) injeksjon knappe9,10. Derfor har ulike mobilnettet merking metoder blitt utviklet, inkludert immunohistology11, luciferase12, grønne fluorescerende protein13 transfection, jernoksid merkingsteknikker for magnetisk resonans imaging (MRI)14 , og mange fluorescerende celle fargestoffer8,15,16. Sammenlignet med arbeidskrevende histology analyser, bruker i vivo ikke-invasiv bildebehandling optiske enheter å oppdage sanntid distribusjon og dynamikken i celler merket med fluorescerende signaler10,17. For funksjonelle levende celle bildebehandling er cytocompatible fluorescerende merking en sofistikert radioaktivt uten sporing teknikk for å avsløre mobilnettet aktiviteter etter stilk cellen transplantasjon18. Videre har multicolor fluorescerende lipofile fargestoffer fordeler over amino-reaktive hydrofile fargestoffer eller fluorescerende proteiner, inkludert forbedret celle permeabilitet og forbedret fluorescens quantum gir19.
Dermed protokollene inkludert her utnytte en rød laser å opphisse celler merket med lipofile carbocyanines gjorde (DilC18(5)), som er en langt rødt fluorescerende Dil (dialkylcarbocyanines) analoge20. De rød-skiftet eksitasjon og utslipp spektra av unngår autofluorescent forstyrrelser og gir dyp-vev imaging over en lang periode i levende dyr8. Denne metoden for sporing celler i vivo merket med gjorde er gyldig for overvåking transplantert stamceller, som haMSCs, i dyremodeller, som er avgjørende for å forstå og forbedre gjeldende stamcelleforskningen regenerativ therapy.
Protocol
Representative Results
Discussion
Standarder og biodistribution studier av stilk cellen terapi er presserende nødvendig før vi kan få regenerativ stilk cellen behandling for KOA fra benken til sengen. Men spiller patologisk miljøet av sykdom en viktig rolle i utholdenhet og biodistribution av transplantert haMSCs10. Nylig vist vår gruppe at intra articular injeksjon av haMSCs varte lenger i en patologisk KOA miljø enn injeksjoner under normale forhold8. Det er mulig at den inflammatoriske og degenerat…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Denne studien ble støttet av Shanghai innovasjon finansiering (1402H 294300) sponset av vitenskap og teknologi provisjon av Shanghai kommune (CN) til Dr. Wen Wang. Vi vil gjerne takke Dr. Guangdong Zhou (National Tissue Engineering Center i Kina) for hans teknisk assistanse og vitenskapelige råd for dette manuskriptet. Vi ønsker også å takke Mr. Huitang Xia (Shanghai niende folks Hospital) for hans hjelp dyrevelferd.
Materials
| Matrx VMR animal anesthesia system | Midmark | VIP3000 | |
| 4-0 suture | Shanghai Jinhuan | KC439 | |
| Razor | Pritech | LD-9987 | |
| Gentamicin | Zhejiang Jindakang Animal Health Product Co., Ltd. | None | |
| 0.9% Sodium chloride solution | Hunan Kelun Pharmaceutical Co., Ltd. | H43020455 | |
| Penicillin | Shanghai Kangfu chemical pharmaceutical Co., Ltd. | None | |
| Buprenorphine | Tianjin Pharmaceutical Research Institute Pharmaceutical Co., Ltd. | None | |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | 16005 | Dilute to final concentration of 10% in PBS |
| EDTA | Sigma-Aldrich | E9884 | Dilute to final concentration of 20% in PBS |
| 0.1% Hematoxylin Solution, Mayer’s | Sigma-Aldrich | MHS16 | |
| 0.5% Eosin Y solution, alcoholic | Sigma-Aldrich | HT110116 | |
| Safranin O | Sigma-Aldrich | S8884 | |
| Fast Green | Sigma-Aldrich | F7258 | |
| Shandon Excelsior ESTM Tissue Processor | Thermo Fisher | A78400006 | |
| Shandon Histocentre™ 3 Tissue Embedding Center | Thermo Fisher | B64100010 | |
| Fully Automated Rotary Microtome | Leica | RM2255 | |
| DiD | Molecular Probes, Life Technologies |
V-22887 | |
| D-MEM High Glucose | Sigma-Aldrich | D5648 | |
| PBS | GIBCO, Life Technologies | 14190-144 | |
| 0.25% Trypsin-EDTA | Invitrogen | 25200-114 | |
| 10 cm Petri Dish | Corning | V118877 | |
| Centrifuge | Beckman | Optima MAX-TL | |
| Fluorescent microscope | Olympus | BX53 | |
| 0.4% Trypan Blue solution | Sigma-Aldrich | 93595 | |
| Titetamme | Virbac (Zoletil 50) | 1000000188 | |
| Zolazepam | Virbac (Zoletil 50) | 1000000188 | |
| Sterile hyposermic syringe for single use 26G | Shanghai Misawa Medical Industry | None | |
| IVIS Spectrum In Vivo Imaging System | PerkinElmer | 124262 | |
| Living Imaging 4.0 software | PerkinElmer | None |
Referências
- Loeser, R. F., Goldring, S. R., Scanzello, C. R., Goldring, M. B. Osteoarthritis: a disease of the joint as an organ. Arthritis Rheum. 64 (6), 1697-1707 (2012).
- Lane, N. E., Shidara, K., Wise, B. L. Osteoarthritis year in review 2016: clinical. Osteoarthritis Cartilage. 25 (2), 209-215 (2017).
- Wang, W., Cao, W. Treatment of osteoarthritis with mesenchymal stem cells. Sci China Life Sci. 57 (6), 586-595 (2014).
- Burke, J., et al. Therapeutic potential of mesenchymal stem cell based therapy for osteoarthritis. Clin Transl Med. 5 (1), 27 (2016).
- Bendele, A. M. Animal models of osteoarthritis. J Musculoskelet Neuronal Interact. 1 (4), 363-376 (2001).
- Gerwin, N., Bendele, A. M., Glasson, S., Carlson, C. S. The OARSI histopathology initiative – recommendations for histological assessments of osteoarthritis in the rat. Osteoarthritis Cartilage. 18, S24-S34 (2010).
- Janusz, M. J., et al. Induction of osteoarthritis in the rat by surgical tear of the meniscus: Inhibition of joint damage by a matrix metalloproteinase inhibitor. Osteoarthritis Cartilage. 10 (10), 785-791 (2002).
- Li, M., et al. In vivo human adipose-derived mesenchymal stem cell tracking after intra-articular delivery in a rat osteoarthritis model. Stem Cell Res Ther. 7 (1), 160 (2016).
- Zhou, B., et al. Administering human adipose-derived mesenchymal stem cells to prevent and treat experimental arthritis. Clin Immunol. 141 (3), 328-337 (2011).
- Desando, G., et al. Intra-articular delivery of adipose derived stromal cells attenuates osteoarthritis progression in an experimental rabbit model. Arthritis Res Ther. 15 (1), 22 (2013).
- Riester, S. M., et al. Safety Studies for Use of Adipose Tissue-Derived Mesenchymal Stromal/Stem Cells in a Rabbit Model for Osteoarthritis to Support a Phase I Clinical Trial. Stem Cells Transl Med. 6 (3), 910-922 (2017).
- Bai, X., et al. Tracking long-term survival of intramyocardially delivered human adipose tissue-derived stem cells using bioluminescence imaging. Mol Imaging Biol. 13 (4), 633-645 (2011).
- Wolbank, S., et al. Labelling of human adipose-derived stem cells for non-invasive in vivo cell tracking. Cell Tissue Bank. 8 (3), 163-177 (2007).
- Heymer, A., et al. Iron oxide labelling of human mesenchymal stem cells in collagen hydrogels for articular cartilage repair. Biomaterials. 29 (10), 1473-1483 (2008).
- Hemmrich, K., Meersch, M., von Heimburg, D., Pallua, N. Applicability of the dyes CFSE, CM-DiI and PKH26 for tracking of human preadipocytes to evaluate adipose tissue engineering. Cells Tissues Organs. 184 (3-4), 117-127 (2006).
- Shim, G., et al. Pharmacokinetics and in vivo fate of intra-articularly transplanted human bone marrow-derived clonal mesenchymal stem cells. Stem Cells Dev. 24 (9), 1124-1132 (2015).
- Chen, B. K., et al. A safety study on intrathecal delivery of autologous mesenchymal stromal cells in rabbits directly supporting Phase I human trials. Transfusion. 55 (5), 1013-1020 (2015).
- Chan, M. M., Gray, B. D., Pak, K. Y., Fong, D. Non-invasive in vivo imaging of arthritis in a collagen-induced murine model with phosphatidylserine-binding near-infrared (NIR) dye. Arthritis Res Ther. 17, 50 (2015).
- Texier, I., et al. Cyanine-loaded lipid nanoparticles for improved in vivo fluorescence imaging. J Biomed Opt. 14 (5), 054005 (2009).
- Honig, M. G., Hume, R. I. Fluorescent carbocyanine dyes allow living neurons of identified origin to be studied in long-term cultures. J Cell Biol. 103 (1), 171-187 (1986).
- Rahmati, M., Mobasheri, A., Mozafari, M. Inflammatory mediators in osteoarthritis: A critical review of the state-of-the-art, current prospects, and future challenges. Bone. 85, 81-90 (2016).
- Detante, O., et al. Intravenous administration of 99mTc-HMPAO-labeled human mesenchymal stem cells after stroke: in vivo imaging and biodistribution. Cell Transplant. 18 (12), 1369-1379 (2009).
- Hu, S. L., et al. In vivo magnetic resonance imaging tracking of SPIO-labeled human umbilical cord mesenchymal stem cells. J Cell Biochem. 113 (3), 1005-1012 (2012).
- Xia, Q., et al. Intra-articular transplantation of atsttrin-transduced mesenchymal stem cells ameliorate osteoarthritis development. Stem Cells Transl Med. 4 (5), 523-531 (2015).
- Jasmin, , et al. Optimized labeling of bone marrow mesenchymal cells with superparamagnetic iron oxide nanoparticles and in vivo visualization by magnetic resonance imaging. J Nanobiotechnology. 9, 4 (2011).
- Lehmann, T. P., et al. Coculture of human nucleus pulposus cells with multipotent mesenchymal stromal cells from human bone marrow reveals formation of tunnelling nanotubes. Mol Med Rep. 9 (2), 574-582 (2014).
- Wang, W., et al. Human adipose-derived mesenchymal progenitor cells engraft into rabbit articular cartilage. Int J Mol Sci. 16 (6), 12076-12091 (2015).
