JoVE Journal > Genetics
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Resultados
Discussion
Declarações
Acknowledgements
Materials
Referências
Tadução automática
Genética

Mikroinjektion af CRISPR/Cas9 Protein i kanal havkat, Ictalurus punctatus, embryoner til Gene Editing

Published: January 20, 2018
doi:
10.3791/56275
, , , , , , ,
1School of Fisheries, Aquaculture and Aquatic Sciences,Auburn University, 2Department of Animal Wealth Development, Faculty of Veterinary Medicine,Suez Canal University, 3Anatomy and Embryology Department, Faculty of Veterinary Medicine,Cairo University, 4Department of Molecular Physiology and Biophysics,Vanderbilt University, 5Life Science Institute,University of Michigan

Summary

En enkel og effektiv mikroinjektion protokol til gen redigering i kanal havkat embryoner ved hjælp af CRISPR/Cas9 system er præsenteret. I denne protokol, guide RNA’er og Cas9 protein var microinjected i blommesækken af én-celle embryoner. Denne protokol er blevet valideret af udskære to kanal havkat immun-relaterede gener.

Abstract

Komplet genomet af kanal havkat, Ictalurus punctatus, er blevet sekventeret, fører til større muligheder for at studere kanal havkat genfunktion. Gen knockout er blevet brugt til at studere disse genet funktioner in vivo. De grupperede regelmæssigt interspaced korte palindromiske gentager/CRISPR forbundet protein 9 (CRISPR/Cas9) system er et kraftfuldt værktøj, der bruges til at redigere genomisk DNA-sekvenser for at ændre genfunktion. Mens den traditionelle tilgang har været at indføre CRISPR/Cas9 mRNA i enkelt celle embryoner gennem mikroinjektion, kan det være en langsom og ineffektiv proces i havkat. Her, er en detaljeret protokol for mikroinjektion af kanal havkat embryoner med CRISPR/Cas9 protein beskrevet. Kort, æg og sæd blev indsamlet og derefter kunstige befrugtning udføres. Befrugtede æg blev overført til en petriskål, som indeholder Holtfreters løsning. Injektionsvolumen blev kalibreret og så guide RNA’er/Cas9 rettet mod den vejafgift/interleukin 1 receptor domæne-holdige adapter molekyle (TICAM 1) genet og rhamnose bindende lektin (RBL) genet blev microinjected i blommesækken af én-celle embryoner. Gen knockout var vellykket indels blev bekræftet af DNA-sekventering. Forudsagte protein sekvens ændringer på grund af disse mutationer inkluderet frameshift og afkortet protein på grund af for tidligt stop kodon.

Introduction

Mikroinjektion er en fælles laboratorium teknik, der anvendes til at levere en lille mængde af et stof som DNA, RNA, protein og andre makromolekyler i celler eller embryoner gennem et glas kapillær1. Mikroinjektion udføres ved hjælp af specialudstyr setup herunder en microinjector, micromanipulator og et mikroskop2. Teknikken er blevet brugt af forskere genetisk ændre mange organismer gennem generation af transgenics, gen knockouts og genterapi, med formålet at forstå dynamikken i intracellulære komponenter3,4 , 5.

Kanal havkat (Ictalurus punctatus) er den mest populære havkat arter i akvakultur og rekreativt fiskeri i USA. Der er et stigende behov for at studere funktionel genomforskning i kanal havkat, og sekventering af komplet genomet af kanal havkat øger nytten af de seneste fremskridt i genom fotoredigering værktøjer6,7. Forstå genfunktioner ville ikke kun berige den forskning, der foregår på havkat, men også føre til mere effektiv genetisk forbedring programmer til at forbedre havkat industrien. Når kritiske gener for en given egenskab af interesse er identificeret, kan de bruges til genetisk forbedring havkat produktionen gennem genom-redigering til at generere gavnlige alleler, udvalg for disse alleler, undertrykke de skadelige alleler, overførsel de gavnlige alleler gennem transgenese, eller en kombination af disse muligheder. Kombinerer de bedste gener for forskellige kommercielt gavnlige egenskaber fra forskellige arter i én fisk ville væsentligt forbedre produktivitet og rentabilitet af fisk produktion operationer8.

Gen knockout er en direkte metode til at studere genet funktioner in vivo. Mutationer i DNA-niveau vil blive arvet af kommende generationer, som vil lette undersøgelsen af deres effekter i forskellige generationer. Forskellige genom redigeringsværktøjer er blevet udviklet herunder zink finger nukleaser (ZFNs), transskription activator-lignende effektor nukleaser (TALENs) og grupperet regelmæssigt interspaced korte palindromiske gentager/CRISPR-forbundet protein 9 (CRISPR/Cas9 ) system9,10,11,12.

CRISPR/Cas9-system er en kraftfulde, effektive værktøj, der er blevet brugt til at redigere genomisk DNA-sekvenser, herunder gen knockout i fisk gennem RNA-styrede lokationsspecifikke DNA kavalergang5,13. Systemet består af en guide-RNA (gRNA), som bestemmer den målrettede sekvens i genomet og et DNA endonuclease enzym, Cas9. CRISPR/Cas9-systemet kan være designet til at målrette en sekvens i genomet med flere fordele over ZFNs og TALENs: (1) lavere omkostninger (2) lettere engineering (3) mere specifik binding af guide RNA til target sekvens, og reduceret off target mutationer (4) flere sekvenser kan målrettes med forskellige gRNA på samme tid (5) høj mutagenese sats i gener, der ikke kunne være muteret af TALENs og (6) forbedret kønscelleoverførsel overførselshastighed på mutationer for op til 6-fold i forhold til ZFNs og TALENs14, 15,16,17,18.

Den vigtigste alternative metode for mikroinjektion er elektroporation, som elektriske impulser anvendes til embryoner eller celler at øge membran permeabilitet og optagelsen af biologiske molekyler19,20. Flere transgene fisk blev genereret ved hjælp af elektroporation medaka (Oryzias latipes), zebrafisk (Danio rerio), chinook laks (Oncorhynchus tshawytscha), kanal havkat, havrude (Sparus sarba), og fælles karper (Cyprinus carpio)21,22,23,24,25,26.

Elektroporation er blevet brugt til at levere plasmid DNA, RNA og Cas9 protein for gen knockout. I pattedyrceller, Cas9/gRNA plasmid DNA, Cas9 mRNA/gRNA og Cas9 protein/gRNA komplekser blev leveret ved hjælp af elektroporation og mutagenese satser var højest ved hjælp af Cas9 protein/gRNA komplekser for de fleste elektroporation betingelser testet27. TALENs udtrykker konstruktioner var i ascidian chordate (Ciona intestinalis), electroporated i befrugtede æg til at fremkalde knockout af flere gener28. ZFNs udtrykker plasmid konstruktioner var electroporated til at udskære luteiniserende hormon i kanal havkat29. Dog når indført ind i cellen, plasmid konstruktioner skal være transskriberes til RNA og oversat til funktionelle proteiner, før de kan målrette den ønskede DNA-sekvens, som sandsynligvis ville udsætte tidspunktet for mutagenese sammenlignet med mikroinjektion af RNA / protein. Som udvikling af et foster, øger forsinket mutagenese mosaicisme af injicerede grundlæggerne. Derudover er transgene udtryk usandsynligt at nå niveauet udtryk muligt med mikroinjektion, sænke mutagenese effektivitet.

Som et middel til at indføre genom redigeringsværktøjer i celler, har mikroinjektion flere fordele over elektroporation. Genom-redigering molekyler kan indføres pålideligt i celler eller embryoner gennem mikroinjektion30. Mindre injektion materiale er nødvendig. Det er nemt at bestemme mængder af materiale sprøjtes. Højere mutation satser med lav mosaicisme i grundlægger fisk kan være opnået, hvilket ville forbedre kønscelleoverførsel transmission af mutationer til F1. Færre grundlægger fisk skal analyseres for at producere den første generation, på grund af den højere Mutationshastighed. I elektroporation skal flere grundlægger fisk analyseres som vil øge omkostningerne. Overlevelse af kanal havkat microinjected embryoner er imidlertid lavere end electroporated dem, selv om dette kan løses ved at indsprøjte flere embryoner31,32. I kanal havkat, overlevelse af æggeblomme-microinjected embryoner varierede fra 16 til 55%, afhængigt af de gener, der er målrettet og dosering af gRNA/Cas9 protein32.

Regelmæssig mikroinjektion af havkat embryoner teknisk krævende og tidskrævende, men en hurtig og effektiv CRISPR/Cas9 protein mikroinjektion protokol er præsenteret for kanal havkat embryoner. Denne protokol kræver mindre tid og ekspertise, da CRISPR/Cas9 protein opløsning indsprøjtes i blommesækken af én celle embryoner. Hundredvis af befrugtede æg kan injiceres i 1 h (ca den nødvendige tid til den første celledeling at forekomme). For at godkende protokollen, blev to sygdom modtagelighed-relaterede gener slået ud i kanalen havkat, adapter vejafgift/interleukin 1 receptor domæne-holdige molekyle (TICAM1) genet og rhamnose bindende lektin (RBL) genet. TICAM 1 er involveret i signalvejen initieret af toll-lignende receptor (TLR) 3. I kanal havkat var TICAM 1 dramatisk upregulated efter bakterielle udfordring med Edwardsiella ictaluri, mens det var downregulated i blå havkat, en art resistent E. ictaluri33. RBL spiller en vigtig rolle i tidlig infektion med Flavobacterium columnare, det agens af columnaris sygdom, hvor akut og robust Opregulering blev indspillet i en columnaris-følsomme kanal havkat stamme i forhold til en columnaris-resistent stamme34.

Protocol

Dette eksperiment blev udført på fisk genetik Research Unit, E. W. Shell fiskeri Research Center, Auburn Universitet, AL. Alle eksperimentelle protokoller, der bruges i dette eksperiment blev godkendt af Auburn University institutionelle Animal Care og brug Udvalget (AU-IACUC) før eksperimentet blev indledt. En liste over det udstyr og forsyninger, der anvendes i dette eksperiment kan findes i tabellen materialer. Følgende er de trin og procedurer for udarbejdelse og mikroinjektion af kanal havkat én-celle embryoner…

Representative Results

For at demonstrere effektiviteten af mikroinjektion protokol, blev gRNAs designet til at målrette kanal havkat vejafgift/interleukin 1 receptor domæne-holdige adapter molekyle (TICAM1) genet og rhamnose bindende lektin (RBL) genet microinjected. TICAM 1DNA-sekventering af vektorer fra enkelte kolonier fra poolede, klonede PCR produkter afslørede indel mutationer induceret i TICAM 1 gen. Den mutation var 7…

Discussion

En detaljeret protokol for mikroinjektion af kanal havkat embryoner at opnå gen knockout blev præsenteret. Injektion af CRISPR/Cas9 protein i blommesækken er meget enklere, sparer tid og kræver ikke omfattende uddannelse i forhold til microinjecting blastodisc af én-celle embryon, som er den fælles teknik til de fleste overførsel af gener og gen redigering med fisk 30 , 42. den nuværende protokol viste sig for at være en succes i overtalelse indels i kan…

Declarações

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Denne forskning er finansieret af USDA-NIFA award 2015-67015-23488 til Roger Cone. Forfatterne takke Dr. Ronald Phelps for beskrivelsen af yngel lager udvælgelseskriterier i videoen. Ahmed Elaswad og Karim Khalil vil gerne takke de egyptiske kulturelle og uddannelsesmæssige Bureau i Washington DC til finansiering af deres Ph.D. forskning.

Materials

Reproboost implant Center of Marine Biotechnology Luteinizing hormone releasing hormone analog (LHRHa) for induction of ovulation in channel catfish females
TRICAINE-S Western Chemical. Inc. For sedation of brood stock fish during hormone injection and egg stripping. 
Phenol red Sigma-Aldrich P0290 0.5%, sterile filtered
Stereo microscope Olympus 213709 For visualizing the eggs during microinjection
Microinjector ASI-Applied Scientific Instrumentation  Model MPPI-3 For the delivery of the injection material into the embryos
Micromanipulator ASI-Applied Scientific Instrumentation  Model MM33  For holding and controlling the movement of the injection needle. 
Eppendorf Microloader Eppendorf 5242956.003 For loading injection solution into microinjection needles.
Vertical needle puller David Kopf Instruments Model 720 For pulling microinjection needles
Cas9 protein PNA Bio Inc.  CP01 Recombinant Cas9 protein from Streptococcus pyrogenes.
Expand High FidelityPLUS PCR System  Roche Diagnostics, USA For PCR and amplification of DNA templates to be used in gRNA preparation
Borosilicate glass capillaries Fisher Scientific 1 mm outer diameter (OD), for making microinjection needles.
Petri dish VWR 25384-302 For holding the embryos during the microinjection.
Crisco The J.M. Smucker Company Vegetable shortening for coating spawning pans and petri dishes. 
Holtfreter`s solution Home Made 59 mM NaCl, 0.67 mM KCl, 2.4 mM NaHCO3, 0.76 mM CaCl2, 1.67 mM MgSO4 to incubate the microinjected embryos till hatch. 
Doxycycline hyclate USP (monohydrate) Letco Medical 690904 Antibiotic added to Holtfreter's solution to 10 ppm to prevent bacterial infections.
DOWNLOAD MATERIALS LIST

Referências

  1. Hammer, R. E., et al. Production of transgenic rabbits, sheep and pigs by microinjection. Nature. 315, 680-683 (1985).
  2. Komarova, Y., Peloquin, J., Borisy, G. . Components of a microinjection system. , 935-939 (2011).
  3. Du, S. J., et al. Growth enhancement in transgenic Atlantic salmon by the use of an "all fish" chimeric growth hormone gene construct. Nat. Biotechnol. 10 (2), 176-181 (1992).
  4. Davis, B., Brown, D., Prokopishyn, N., Yannariello-Brown, J. Micro-injection-mediated hematopoietic stem cell gene therapy. Curr. Opin. Mol. Ther. 2 (4), 412-419 (2000).
  5. Jao, L. E., Wente, S. R., Chen, W. Efficient multiplex biallelic zebrafish genome editing using a CRISPR nuclease system. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 110 (34), 13904-13909 (2013).
  6. Liu, Z., et al. The channel catfish genome sequence provides insights into the evolution of scale formation in teleosts. Nat. Commun. 7, (2016).
  7. Abdelrahman, H., et al. Aquaculture genomics, genetics and breeding in the United States: current status, challenges, and priorities for future research. BMC Genomics. 18 (1), 191 (2017).
  8. Dunham, R. A. . Aquaculture and Fisheries Biotechnology : Genetic Approaches. , (2011).
  9. Miller, J. C., et al. An improved zinc-finger nuclease architecture for highly specific genome editing. Nat. Biotechnol. 25 (7), 778-785 (2007).
  10. Doyon, Y., et al. Heritable targeted gene disruption in zebrafish using designed zinc-finger nucleases. Nat. Biotechnol. 26 (6), 702-708 (2008).
  11. Miller, J. C., et al. A TALE nuclease architecture for efficient genome editing. Nat. Biotechnol. 29 (2), 143-148 (2011).
  12. Ran, F. A., et al. Genome engineering using the CRISPR-Cas9 system. Nat. Protoc. 8 (11), 2281-2308 (2013).
  13. Hwang, W. Y., et al. Efficient genome editing in zebrafish using a CRISPR-Cas system. Nat. Biotechnol. 31 (3), 227-229 (2013).
  14. Cong, L., et al. Multiplex genome engineering using CRISPR/Cas systems. Science. 339 (6121), 819-823 (2013).
  15. Cradick, T. J., Fine, E. J., Antico, C. J., Bao, G. CRISPR/Cas9 systems targeting β-globin and CCR5 genes have substantial off-target activity. Nucleic Acids Res. 41 (20), 9584-9592 (2013).
  16. Hruscha, A., et al. Efficient CRISPR/Cas9 genome editing with low off-target effects in zebrafish. Development. 140 (24), 4982-4987 (2013).
  17. Varshney, G. K., et al. High-throughput gene targeting and phenotyping in zebrafish using CRISPR/Cas9. Genome Res. 25 (7), 1030-1042 (2015).
  18. Li, M., Zhao, L., Page-McCaw, P. S., Chen, W. Zebrafish genome engineering using the CRISPR-Cas9 system. Trends Genet. 32 (12), 815-827 (2016).
  19. Neumann, E., Schaefer-Ridder, M., Wang, Y., Hofschneider, P. Gene transfer into mouse lyoma cells by electroporation in high electric fields. The EMBO Journal. 1 (7), 841 (1982).
  20. Powers, D. A., et al. Electroporation: a method for transferring genes into the gametes of zebrafish (Brachydanio rerio), channel catfish (Ictalurus punctatus), and common carp (Cyprinus carpio). Mol. Mar. Biol. Biotechnol. 1 (4-5), 301-308 (1991).
  21. Inoue, K., et al. Electroporation as a new technique for producing transgenic fish. Cell Differ. Dev. 29 (2), 123-128 (1990).
  22. Buono, R., Linser, P. Transient expression of RSVCAT in transgenic zebrafish made by electroporation. Mol. Mar. Biol. Biotechnol. 1 (4-5), 271-275 (1991).
  23. Sin, F., et al. Gene transfer in chinook salmon (Oncorhynchus tshawytscha) by electroporating sperm in the presence of pRSV-lacZ DNA. Aquaculture. 117 (1-2), 57-69 (1993).
  24. Dunham, R. A., et al. Enhanced bacterial disease resistance of transgenic channel catfish Ictalurus punctatus possessing cecropin genes. Mar. Biotechnol. 4 (3), 338-344 (2002).
  25. Lu, J. K., Fu, B. H., Wu, J. L., Chen, T. T. Production of transgenic silver sea bream (Sparus sarba) by different gene transfer methods. Mar. Biotechnol. 4 (3), 328-337 (2002).
  26. Cheng, Q., et al. Interaction of diet and the masou salmon Δ5-desaturase transgene on Δ6-desaturase and stearoyl-CoA desaturase gene expression and N-3 fatty acid level in common carp (Cyprinus carpio). Transgenic Res. 23 (5), 729-742 (2014).
  27. Liang, X., et al. Rapid and highly efficient mammalian cell engineering via Cas9 protein transfection. J. Biotechnol. 208, 44-53 (2015).
  28. Treen, N., et al. Tissue-specific and ubiquitous gene knockouts by TALEN electroporation provide new approaches to investigating gene function in Ciona. Development. 141 (2), 481-487 (2014).
  29. Qin, Z., et al. Editing of the luteinizing hormone gene to sterilize channel catfish, Ictalurus punctatus, using a modified zinc finger nuclease technology with electroporation. Mar. Biotechnol. 18 (2), 255-263 (2016).
  30. Qin, Z. . Gene editing of luteinizing hormone, follicle-stimulating hormone and gonadotropin-releasing hormone genes to sterilize channel catfish, Ictalurus punctatus, using zinc finger nuclease, transcription activator-like effector nuclease and clustered regularly interspaced short palindromic repeats/Cas9 technologies. , (2015).
  31. Dunham, R. A., Winn, R. N., Pinkert, C. A. . Transgenic Animal Technology: A Laboratory Handbook. , 308-336 (2014).
  32. Elaswad, A. . Genetic technologies for disease resistance research and enhancement in catfish. , (2016).
  33. Baoprasertkul, P., Peatman, E., Somridhivej, B., Liu, Z. Toll-like receptor 3 and TICAM genes in catfish: species-specific expression profiles following infection with Edwardsiella ictaluri. Immunogenetics. 58 (10), 817-830 (2006).
  34. Thongda, W., Li, C., Luo, Y., Beck, B. H., Peatman, E. L-rhamnose-binding lectins (RBLs) in channel catfish, Ictalurus punctatus: Characterization and expression profiling in mucosal tissues. Dev. Comp. Immunol. 44 (2), 320-331 (2014).
  35. Phelps, R. P., et al. Effects of temperature on the induced spawning of channel catfish and the production of channel× blue catfish hybrid fry. Aquaculture. 273 (1), 80-86 (2007).
  36. Poole, W., Dillane, M. Estimation of sperm concentration of wild and reconditioned brown trout, Salmo trutta L. Aquacult. Res. 29 (6), 439-445 (1998).
  37. Billard, R. Spermatogenesis and spermatology of some teleost fish species. Reprod. Nutr. Dev. 26 (4), 877-920 (1986).
  38. Coyle, S. D., Durborow, R. M., Tidwell, J. H. . Anesthetics in aquaculture. , (2004).
  39. Shah, A. N., Davey, C. F., Whitebirch, A. C., Miller, A. C., Moens, C. B. Rapid reverse genetic screening using CRISPR in zebrafish. Nat. Methods. 12 (6), 535-540 (2015).
  40. Armstrong, J., Duhon, S., Malacinski, G. . Developmental Biology of the Axolotl. , 220-227 (1989).
  41. Porazinski, S. R., Wang, H., Furutani-Seiki, M. Microinjection of medaka embryos for use as a model genetic organism. J. Vis. Exp. (46), (2010).
  42. Erickson, P. A., Ellis, N. A., Miller, C. T. Microinjection for transgenesis and genome editing in threespine sticklebacks. J. Vis. Exp. (111), e54055 (2016).
  43. Rosen, J. N., Sweeney, M. F., Mably, J. D. Microinjection of zebrafish embryos to analyze gene function. J. Vis. Exp. (25), e1115 (2009).
  44. Silverstein, J. T., Small, B. C., Tucker, C. S., Hargreaves, J. A. . Biology and Culture of Channel Catfish. 34, 69-94 (2004).
  45. Su, B., et al. Relative effectiveness of carp pituitary extract, luteininzing hormone releasing hormone analog (LHRHa) injections and LHRHa implants for producing hybrid catfish fry. Aquaculture. 372, 133-136 (2013).
  46. Aluru, N., et al. Targeted mutagenesis of aryl hydrocarbon receptor 2a and 2b genes in Atlantic killifish (Fundulus heteroclitus). Aquat. Toxicol. 158, 192-201 (2015).
  47. Chang, N., et al. Genome editing with RNA-guided Cas9 nuclease in zebrafish embryos. Cell Res. 23 (4), 465-472 (2013).
  48. Edvardsen, R. B., Leininger, S., Kleppe, L., Skaftnesmo, K. O., Wargelius, A. Targeted mutagenesis in Atlantic salmon (Salmo salar L.) using the CRISPR/Cas9 system induces complete knockout individuals in the F0 generation. PLoS ONE. 9 (9), e108622 (2014).
  49. Li, M., et al. Efficient and heritable gene targeting in tilapia by CRISPR/Cas9. Genética. 197 (2), 591-599 (2014).
  50. Zhong, Z., et al. Targeted disruption of sp7 and myostatin with CRISPR-Cas9 results in severe bone defects and more muscular cells in common carp. Sci. Rep. 6, (2016).
  51. Chakrapani, V., et al. Establishing targeted carp TLR22 gene disruption via homologous recombination using CRISPR/Cas9. Dev. Comp. Immunol. 61, 242-247 (2016).
  52. Lim, J., Ghadessy, F. J., Yong, E. A novel splice site mutation in the androgen receptor gene results in exon skipping and a non-functional truncated protein. Mol. Cell. Endocrinol. 131 (2), 205-210 (1997).
  53. Gatfield, D., Unterholzner, L., Ciccarelli, F. D., Bork, P., Izaurralde, E. Nonsense-mediated mRNA decay in Drosophila: at the intersection of the yeast and mammalian pathways. The EMBO Journal. 22 (15), 3960-3970 (2003).
  54. Talerico, M., Berget, S. M. Effect of 5’splice site mutations on splicing of the preceding intron. Mol. Cell. Biol. 10 (12), 6299-6305 (1990).

Tags

CRISPR/Cas9MicroinjectionChannel CatfishIctalurus PunctatusGene EditingTICAM1RBLBroodstock SelectionSpawningLHRHAHormone InjectionEmbryoProtocolFunctional Genomics
check_url/pt/56275?article_type=t

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Citar este artigo
Elaswad, A., Khalil, K., Cline, D., Page-McCaw, P., Chen, W., Michel, M., Cone, R., Dunham, R. Microinjection of CRISPR/Cas9 Protein into Channel Catfish, Ictalurus punctatus, Embryos for Gene Editing. J. Vis. Exp. (131), e56275, doi:10.3791/56275 (2018).
Baixar citação
Reimpressões e Permissões

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image