Microinjeção de proteína CRISPR/Cas9 em bagre do canal, Ictalurus punctatus, embriões para Gene Editing

Summary

Um protocolo simples e eficiente de microinjeção para edição de genes em embriões de bagre de canal usando o sistema CRISPR/Cas9 é apresentado. Neste protocolo, guia de RNAs e proteínas Cas9 foram injetadas na gema de uma célula de embriões. Este protocolo foi validado por nocauteando dois genes imune-relacionados de bagre do canal.

Abstract

O genoma completo do bagre do canal, Ictalurus punctatus, foi sequenciado, levando a maiores oportunidades para estudar a função do gene de bagre do canal. Nocaute de gene tem sido usada para estudar estas funções de gene em vivo. O cluster regularmente intercaladas curta palíndromo repetições/CRISPR associado da proteína 9 (CRISPR/Cas9) sistema é uma poderosa ferramenta usada para editar sequências genomic do DNA para alterar a função do gene. Embora a abordagem tradicional tem sido introduzir os embriões de célula única através de microinjeção CRISPR/Cas9 mRNA, esse pode ser um processo lento e ineficiente em bagre. Aqui, um protocolo detalhado para microinjeção de embriões channel catfish com proteína CRISPR/Cas9 é descrito. Brevemente, óvulos e espermatozoides foram coletada e então artificial fertilização realizada. Ovos fertilizados foram transferidos para uma placa de Petri contendo solução do Holtfreter. Volume de injeção foi calibrada e então guia RNAs/Cas9 alvejando o pedágio/interleucina 1 receptor domínio-contendo adaptador molécula (TICAM 1) gene e gene de lectina (RBL) de vinculação de ramnose foram injetadas na gema de uma célula de embriões. O nocaute do gene foi bem-sucedido como puntuais foram confirmados por sequenciamento de DNA. As alterações de sequência da proteína predita devido a estas mutações incluíam frameshift e truncado proteína devido códons de parada prematura.

Introduction

Microinjeção é uma técnica comum de laboratório usada para entregar uma pequena quantidade de uma substância como DNA, RNA, proteínas e outras macromoléculas em células ou de embriões através de um capilar de vidro¹. Microinjeção é executada usando a instalação de equipamentos especiais, incluindo um microinjector e um microscópio²micromanipulador. A técnica tem sido usada por pesquisadores para modificar geneticamente muitos organismos através da geração de transgênicos, gene nocautes e terapia genética, com o objectivo de compreensão da dinâmica dos componentes intracelulares^3,

Protocol

Este experimento foi conduzido na unidade de pesquisa genética de peixes, E. W. Shell Fisheries Research Center, Universidade de Auburn, AL. Todos os protocolos experimentais utilizados neste experimento foram aprovados pelo Comitê de uso (AU-IACUC) e Auburn University institucional Cuidado Animal antes que o experimento foi iniciado. Uma lista de equipamentos e suprimentos usados neste experimento pode ser encontrada na tabela de materiais. A seguir estão as etapas e procedimentos para a preparação e microinjeção de embriões de uma célula de bagre do canal conforme ilustrado na Figura 1.

1. ninhada de desova e s....

Results

Para demonstrar a eficiência do protocolo microinjeção, foram injetadas gRNAs projetados para atingir o channel catfish pedágio/interleucina 1 gene do receptor domínio-contendo adaptador molécula (TICAM1) e ramnose gene de lectina (RBL) de vinculação.

TICAM 1
Sequenciamento de DNA de vetores de colónias individuais de produtos PCR em pool, clonados revelou as mutações indel induzidas em TICAM 1 gene. A taxa d.......

Discussion

Foi apresentado um protocolo detalhado para microinjeção de embriões de bagre do canal para conseguir o nocaute do gene. Injeção de proteína CRISPR/Cas9 a gema é muito mais simples, economiza tempo e não requer treinamento extensivo em relação ao microinjecting o discoidal do embrião de uma célula, que é a técnica comum para a maioria das transferência do gene e gene edição com peixe ^{30 , 42}. o protocolo atual provou para ser bem sucedido na indução puntuais em c.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Implante Reproboost	Centro de Biotecnologia Marinha		Análogo do hormônio liberador do hormônio luteinizante (LHRHa) para indução da ovulação em fêmeas de bagre de canal
TRICAINE-S	Western Chemical. Inc.		Para sedação de peixes reprodutores durante a injeção de hormônio e remoção de ovos.
Fenol vermelho	Sigma-Aldrich	P0290	0,5%, filtrado estéril
Microscópio estéreo	Olympus	213709	Para visualizar os ovos durante a microinjeção
Microinjetor	ASI-Applied Scientific Instrumentation	Modelo MPPI-3	Para a entrega do material de injeção nos embriões
Micromanipulador	ASI-Applied Scientific Instrumentation	Modelo MM33	Para segurar e controlar o movimento da agulha de injeção.
Microcarregador Eppendorf Eppendorf		5242956.003	Para carregar solução de injeção em agulhas de microinjeção.
Extrator de agulhas vertical	David Kopf Instruments	Modelo 720	Para puxar agulhas de microinjeção
Proteína Cas9	PNA Bio Inc.	CP01	Proteína Cas9 recombinante de Streptococcus pyrogenes.
Expanda o sistema de PCR High FidelityPLUS	Roche Diagnostics, EUA		Para PCR e amplificação de modelos de DNA a serem usados na preparação de gRNA
Capilares de vidro borossilicato	Fisher Scientific		1 mm de diâmetro externo (OD), para fazer agulhas de microinjeção.
Placa de Petri	VWR	25384-302	Para segurar os embriões durante a microinjeção.
Crisco	The J.M. Smucker Company		Gordura vegetal para revestimento de panelas de desova e placas de Petri.
Solução da Holtfreter	Home Made		59 mM NaCl, 0.67 mM KCl, 2.4 mM NaHCO3, 0.76 mM CaCl2, 1.67 mM MgSO4 para incubar os embriões microinjetados até a eclosão.
Hidrato de doxiciclina USP (monohidratado)	Letco Medical	690904	Antibiótico adicionado à solução da Holtfreter a 10 ppm para prevenir infecções bacterianas.