Construcción y evaluación de un modelo murino Osteolysis Calvarial por exposición a partículas de CoCrMo en aflojamiento aséptico
Summary
Este manuscrito describe un modelo murino osteolysis calvarial por exposición a partículas de CoCrMo, que constituye un modelo animal ideal para la evaluación de las interacciones entre las partículas de desgaste y diversas células en aflojamiento aséptico.
Abstract
Osteólisis inducida por partículas de desgaste es una de las principales causas del aflojamiento aséptico en el fracaso de la artroplastia, pero el mecanismo subyacente es incierto. Debido al largo seguimiento necesarios para detección y ocurrencia esporádica, es difícil evaluar la osteólisis inducida por el ofparticle de patogenesia en casos clínicos. Por lo tanto, modelos animales óptimos se requieren estudios adicionales. El modelo murino de osteólisis calvarial establecido por la exposición a partículas de CoCrMo es una herramienta eficaz y válida para evaluar las interacciones entre las partículas y diversas células en aflojamiento aséptico. En este modelo, las partículas de CoCrMo primero fueron obtenidas por alto vacío de tres electrodos corriente y resuspendió en solución salina con tampón fosfato a una concentración de 50 mg/mL. Entonces, 50 μl de la suspensión resultante se aplicó a la mitad de la calvaria murino después de la separación del periostio craneal por agudo disección. Después de dos semanas, los ratones fueron sacrificados y se cosecharon muestras de la calvaria; se realizaron evaluaciones cualitativas y cuantitativas por hematoxilina y eosina y micro tomografía computada. Los puntos fuertes de este modelo incluyen simplicidad de procedimiento, evaluación cuantitativa de la pérdida de masa ósea, rapidez de desarrollo de osteólisis, uso potencial transgénico o knockout modelos y un costo relativamente bajo. Sin embargo, este modelo no puede utilizarse para evaluar la fuerza mecánica y efectos crónicos de las partículas en aflojamiento aséptico. Modelo murino osteolysis calvarial generado por la exposición a partículas de CoCrMo es una herramienta ideal para evaluar las interacciones entre las partículas de desgaste y varias células, por ejemplo, los macrófagos, fibroblastos, osteoblastos y osteoclastos, en aflojamiento aséptico.
Introduction
Aflojamiento aséptico es la causa más común de artroplastia total de cadera (THA) y fracaso de la artroplastia (TKA) total de la rodilla, que requiere de cirugía de revisión1. Sin embargo, el mecanismo subyacente permanece claro2. Una carta recordativa larga es necesaria para detectar la osteólisis inducida por partículas cuya ocurrencia es rara; por lo tanto, es un reto a explorar su patogenesia en casos clínicos. Por lo tanto, estudios más centrados en mecanismos celulares y tejidos complejos requieren que ambos experimentos en vivo en usan modelos de la osteólisis inducida por partículas y en vitro ensayos en células relacionadas con la homeostasis3del hueso. Un modelo animal válido es importante en revelar los efectos de las partículas de desgaste en la pérdida ósea, proporcionando la evidencia para otros ensayos celulares.
Un modelo murino osteolysis calvarial construido por exposición a partículas de CoCrMo es un método efectivo y válido para evaluar las interacciones entre las partículas y diversas células en aflojamiento aséptico. En este modelo, partículas de CoCrMo causan osteólisis calvarial induciendo citoquinas inflamatorias en macrófagos, activación de osteoclastos, inhibiendo la proliferación de osteoblastos, y promover la apoptosis de osteoblastos.
Sólo se tarda dos semanas para establecer este modelo. Osteólisis puede ser visualizada y cuantificada por hematoxilina y eosina (H & E) coloración y micro computarizada de tomografía (micro-CT)2. Además, este modelo tiene un ratón de relativamente bajo costo y transgénico y knockout modelos pueden utilizarse para un gran número de compuestos en diversas dosis3.
El procedimiento para establecer y evaluar este modelo es simple. En primer lugar, las partículas de CoCrMo fueron obtenidas por alto vacío de tres electrodos corriente y resuspendió en solución salina tamponada con fosfato (PBS) a una concentración de 50 mg/mL. Entonces, 50 μl de la suspensión resultante se aplicó a la mitad de la calvaria murino después de la separación del periostio craneal por agudo disección. Los ratones fueron sacrificados después de dos semanas, y se cosecharon muestras de la calvaria; se realizaron análisis cualitativos y cuantitativos por H & E tinción andmicro-CT.
Un modelo murino osteolysis calvarial construido por exposición a partículas de CoCrMo es una herramienta ideal para evaluar las interacciones entre las partículas de CoCrMo y varias células, como macrófagos, fibroblastos, osteoblastos y osteoclastos, en aflojamiento aséptico.
Protocol
Representative Results
Discussion
Existen dos métodos principales para la osteólisis inducida por partículas de desgaste en ratones: el modelo de bolsa de aire y el modelo de osteólisis calvarial. En el modelo de bolsa de aire, una bolsa de aire subcutáneo generada se establece primero, seguido por la introducción de partículas de desgaste y la implantación en el tejido óseo del8. La pared de bolsa imita el periostio en aflojamiento aséptico. Sin embargo, la implantación de hueso es no vascular sin actividad biológica,…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este estudio fue apoyado por la Fundación Nacional de Ciencias naturales de China (81572111), la clínica de la ciencia y tecnología proyecto de Fundación de la provincia de Jiangsu (BL2012002), el proyecto de investigación científica de Nanjing (201402007), la Ciencia Natural Fundación de la provincia de Jiangsu (BK20161385) y la Fundación especial de asociación médico chino (2015COS0810).
Materials
| CoCrMo alloy from prosthesis | Waldemar Link GmbH & Co | GEMINI MK II | Raw material to obtain CoCrMo nanoparticles |
| Fabricated high-vacuum three-electrode direct current | College of Materials Science & Engineering , Nanjing University of Technology | Self designed machine | |
| 6 week old male C57BL/6J mice | Model animal research center of Nanjing University | N000013 | |
| 100% Ethanol | Nanjing Reagent | C0691514023 | Solvent of CoCrMo nanoparticles for transmission electron microscope scanning |
| 1.5 ml Microcentrifuge tubes | Taizhou Weierkang Medical Supplies co., LTD | W603 | |
| Microanalytical balance | Shenzhen Qun long Instrument Equipment Co,. LTD | EX125DZH | |
| Ultrasonic shaker | Shanghai Yuhao scientific instrument co., LTD | YH-200DH | To suspend CoCrMo nanoparticles |
| Transmission Electron Microscope | FEI | Tecnai G20 | |
| SimplePCI software | Compix Inc. | 6.6 version | To calculate the mean diameter and particle size distribution. |
| High-handed sterilization pan | QIULONGYIQI | KYQL-100DS | To decontaminate endotoxin |
| Limulus Amebocyte Lysate (LAL) Assay | Charles River | R13025 | To detect endotoxin |
| 15 ml Microcentrifuge tubes | Taizhou Suyi Medical | B122 | |
| Phosphate-buffered saline | Boster Biological Technology | AR0030 | Solvent of CoCrMo nanoparticles stock solution |
| Pentobarbital Sodium | Sigma | P3761 | To anesthetize mice |
| Normal saline | SACKLER | SR8572EP-15 | To prevent drying of mice eyes |
| 75% Ethanol | Nanjing Reagent | C0691560275 | Disinfection |
| Medical cotton ball | Shuitao | 1278298933 | Disinfection |
| Shaver | Kemei | KM-3018 | To shave the fur |
| Scissor | RWD LIFE SCIENCE | S12005-10 | To incise skin |
| Suture | RWD LIFE SCIENCE | F34001-01 | To suture skin |
| Needle holder | RWD LIFE SCIENCE | F33001-01 | To suture skin |
| Needle | RWD LIFE SCIENCE | R14003-12 | To suture skin |
| Vessel forceps | RWD LIFE SCIENCE | F22003-09 | To suture skin |
| Scalpel | RWD LIFE SCIENCE | S31010-01 | To harvest calvaria |
| Tweezers | RWD LIFE SCIENCE | F12006-10 | To harvest calvaria |
| 100 µL pipettes | Eppendorf | 3120000240 | To embed particles suspension in the calvatias |
| 100 µL pipette tips | AXYGEN | T-200-Y | To embed particles suspension in the calvatias |
| 5 ml Microtubes | Taizhou Weierkang Medical Supplies co., LTD | W621 | |
| 4% Paraformaldehyde | Servicebio | G1101 | Fixation |
| Micro Computed Tomography | SkyScan | SkyScan1176 | |
| Ethylene Diamine Tetraacetic Acid | Servicebio | G1105 | Decalcification |
| Paraffin | Servicebio | #0001 | |
| Paraffin slicing machine | Leica | RM2125RTS | |
| Glass slide | Servicebio | G6004 | |
| Cover glass | Servicebio | 200 | |
| HE staining kit | Servicebio | #1-5 | HE staining |
| Light microscope | Nikon | E200 |
Referências
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