Summary

Konstruksjon og evaluering av en Murine Calvarial Osteolysis modell av eksponering for CoCrMo partikler i aseptiske løsne

Published: February 17, 2018
doi:

Summary

Dette manuskriptet beskriver en murine calvarial osteolysis modell av eksponering for CoCrMo partikler, som utgjør en ideell dyr modell for vurdering av samspillet mellom slitasje partikler og ulike celler i aseptiske løsne.

Abstract

Slitasje partikkel-indusert osteolysis er en viktig årsak til aseptiske løsne kirurgi feil, men den underliggende mekanismen er fortsatt uklart. På grunn av lang oppfølging nødvendig for deteksjon og sporadiske forekomst, er det utfordrende for å vurdere patogenesen ofparticle-indusert osteolysis i kliniske tilfeller. Derfor kreves optimal dyremodeller for videre studier. Murine modell av calvarial osteolysis etablert av eksponering for CoCrMo partikler er en effektiv og gyldig verktøyet for vurdering av samspillet mellom partikler og ulike celler i aseptiske løsne. I denne modellen, ble CoCrMo partikler først innhentet av høy-vakuum tre elektrode likestrøm og resuspended i fosfat-bufret saltvann i en konsentrasjon av 50 mg/mL. Deretter ble 50 µL av resulterende suspensjon brukt til midten av de murine calvaria etter separasjon av den kraniale periosteum av skarpe disseksjon. Etter to uker, musene ble ofret, og calvaria eksemplarer ble høstet; kvalitativ og kvantitativ evalueringene ble utført av hematoxylin og eosin flekker og mikro beregnet tomografi. Styrken i denne modellen inkluderer prosedyren enkelhet, kvantitativ vurdering av bentap, hurtighet i osteolysis utvikling, potensielle bruk transgene eller knockout modeller og en relativt lav kostnad. Men denne modellen kan ikke brukes til å vurdere mekanisk kraft og kroniske virkninger av partikler i aseptiske løsne. Murine calvarial osteolysis modell generert av eksponering for CoCrMo partikler er et ideelt verktøy for vurdering av samspillet mellom slitasje partikler og ulike celler, f.eks, makrofager, fibroblaster, osteoblasts og osteoklast i aseptiske løsne.

Introduction

Aseptiske løsner er den vanligste årsaken totale hip kirurgi (THA) og totalt kneet kirurgi (TKA) feil, som krever revision kirurgi1. Den underliggende mekanismen er imidlertid uklart2. En lang oppfølging er nødvendig for å oppdage partikkel-indusert osteolysis, hvis forekomst er sjelden; Derfor er det utfordrende for å utforske sin patogenese i kliniske tilfeller. Derfor krever videre studier med fokus på komplekse cellular og vev mekanismer både i vivo eksperimenter i bære partikkel-indusert osteolysis modeller og i vitro analyser i celler knyttet til bein homeostase3. En gyldig dyremodell er viktig i avslørende effekten av slitasje partikler på bentap, gir bevis for ytterligere mobilnettet analyser.

Murine calvarial osteolysis modell bygget av eksponering for CoCrMo partikler er en effektiv og gyldig metode for vurdering av samspillet mellom partikler og ulike celler i aseptiske løsne. I denne modellen forårsake CoCrMo partikler calvarial osteolysis ved inducing inflammatoriske cytokiner i makrofager, aktivere osteoklast, hemmer osteoblast spredning og fremme osteoblast apoptose.

Det tar bare to uker å etablere denne modellen. Osteolysis kan visualisere og kvantifisert ved hematoxylin og eosin (H & E) flekker og mikro beregnet tomografi (mikro-CT)2. Dessuten, har denne modellen en relativt lav pris, og transgene og knockout mus modeller kan brukes til en rekke forbindelser på ulike doser3-skjermen.

Prosedyren for å etablere og evaluere denne modellen er enkel. Først ble CoCrMo partikler innhentet av høy-vakuum tre elektrode likestrøm og resuspended i fosfat-bufret saltvann (PBS) i en konsentrasjon av 50 mg/mL. Deretter ble 50 µL av resulterende suspensjon brukt til midten av de murine calvaria etter separasjon av den kraniale periosteum av skarpe disseksjon. Mus ble ofret etter to uker, og calvaria prøver ble høstet; kvalitative og kvantitative analyser ble utført av H & E flekker andmicro-CT.

Murine calvarial osteolysis modell bygget av eksponering for CoCrMo partikler er et ideelt verktøy for vurdering av samspillet mellom CoCrMo partikler og ulike celler, som makrofager, fibroblaster, osteoblasts og osteoklast i aseptiske løsne.

Protocol

Alle metodene som er beskrevet her er godkjent av institusjonelle Animal Care og bruk Committee (IACUC) i Nanjing universitet. 1. CoCrMo partikkel forberedelse Få CoCrMo partikler ved hjelp av en fabrikkert høy-vakuum tre elektrode likestrøm4. Plass CoCrMo legering i apparatet under 10-3 Pa vakuum, 0.04 MPa argon og hydrogen 3:2 (v/v), og 650 A katoden gjeldende. Måle diameter av CoCrMo partikler. Legge til 1 mg av CoCrMo parti…

Representative Results

Internt produsert nanoskala CoCrMo partikler var rundt 50 nm (standardfeil for 3.56) i diameter, som kvantifisert ved TEM (figur 2). Etter eksponering for musen calvarias CoCrMo partikler, dyrene (n = 6 per gruppe) ble opprettholdt for en annen to uker. De to ukene calvarial innsnitt var fullstendig helbredet og suture kan falle. Noen lokale infeksjon eller nonunion kan påvirke bein tap vurdering. Etter musen offer, ble calvaria prøver høstet. Deretter all…

Discussion

Det er to hovedmetoder for slitasje partikkel-indusert osteolysis i mus: air-pose modellen og calvarial osteolysis modellen. I luft-veske modell, er en subcutaneously generert luft-veske etablert, etterfulgt av slitasje partikkel introduksjon og implantasjon i bein vev8. Veske veggen etterligner periosteum i aseptiske løsne. Bein implantasjon er imidlertid nonvascular uten biologisk aktivitet, som gjør det vanskelig å vurdere direkte interaksjoner mellom partikler og benvevet. Calvarial osteoly…

Declarações

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Denne studien ble støttet av den nasjonale Natural Science Foundation i Kina (81572111), klinisk vitenskap og teknologi prosjektet Foundation av Jiangsu provinsen (BL2012002), vitenskapelig forskning prosjekt av Nanjing (201402007), Natural Science Grunnlaget for Jiangsu provinsen (BK20161385), og spesielle grunnlaget for kinesisk lege Association (2015COS0810).

Materials

CoCrMo alloy from prosthesis Waldemar Link GmbH & Co GEMINI MK II Raw material to obtain CoCrMo nanoparticles
Fabricated high-vacuum three-electrode direct current College of Materials Science & Engineering , Nanjing University of Technology Self designed machine
6 week old male C57BL/6J mice Model animal research center of Nanjing University N000013
100% Ethanol Nanjing Reagent C0691514023 Solvent of CoCrMo nanoparticles for transmission electron microscope scanning
1.5 ml Microcentrifuge tubes Taizhou Weierkang Medical Supplies co., LTD W603
Microanalytical balance Shenzhen Qun long Instrument Equipment Co,. LTD EX125DZH
Ultrasonic shaker Shanghai Yuhao scientific instrument co., LTD YH-200DH To suspend CoCrMo nanoparticles
Transmission Electron Microscope FEI Tecnai G20
SimplePCI software Compix Inc. 6.6 version To calculate the mean diameter and particle size distribution.
High-handed sterilization pan QIULONGYIQI KYQL-100DS To decontaminate endotoxin
Limulus Amebocyte Lysate (LAL) Assay Charles River R13025 To detect endotoxin 
15 ml Microcentrifuge tubes Taizhou Suyi Medical B122
Phosphate-buffered saline Boster Biological Technology AR0030 Solvent of CoCrMo nanoparticles stock solution
Pentobarbital Sodium Sigma P3761 To anesthetize mice
Normal saline SACKLER SR8572EP-15 To prevent drying of mice eyes
75% Ethanol Nanjing Reagent C0691560275 Disinfection
Medical cotton ball Shuitao 1278298933 Disinfection
Shaver Kemei KM-3018 To shave the fur
Scissor RWD LIFE SCIENCE S12005-10 To incise skin
Suture RWD LIFE SCIENCE F34001-01 To suture skin
Needle holder RWD LIFE SCIENCE F33001-01 To suture skin
Needle RWD LIFE SCIENCE R14003-12 To suture skin
Vessel forceps RWD LIFE SCIENCE F22003-09 To suture skin
Scalpel RWD LIFE SCIENCE S31010-01 To harvest calvaria
Tweezers RWD LIFE SCIENCE F12006-10 To harvest calvaria
100 µL pipettes Eppendorf 3120000240 To embed particles suspension in the calvatias
100 µL pipette tips AXYGEN T-200-Y To embed particles suspension in the calvatias
5 ml Microtubes Taizhou Weierkang Medical Supplies co., LTD W621
4% Paraformaldehyde Servicebio G1101 Fixation
Micro Computed Tomography  SkyScan SkyScan1176
Ethylene Diamine Tetraacetic Acid Servicebio G1105 Decalcification
Paraffin Servicebio #0001
Paraffin slicing machine Leica RM2125RTS
Glass slide Servicebio G6004
Cover glass Servicebio 200
HE staining kit Servicebio #1-5 HE staining
Light microscope Nikon E200

Referências

  1. Dong, L., et al. Antisense oligonucleotide targeting TNF-alpha can suppress Co-Cr-Mo particle-induced osteolysis. J Orthop Res. 26 (8), 1114-1120 (2008).
  2. Deng, Z., et al. SIRT1 protects osteoblasts against particle-induced inflammatory responses and apoptosis in aseptic prosthesis loosening. Acta Biomater. 49, 541-554 (2017).
  3. Langlois, J., Hamadouche, M. New animal models of wear-particle osteolysis. Int Orthop. 35 (2), 245-251 (2011).
  4. Wang, P., Zhao, F. X., Zhang, Z. Z. Preparation of ultrafine zinc powders by DC arc plasma evaporation method. Chinese Journal of Nonferrous Metals. 21 (9), 2236-2241 (2011).
  5. Wang, Z., et al. The fibroblast expression of RANKL in CoCrMo-particle-induced osteolysis is mediated by ER stress and XBP1s. Acta Biomater. 24, 352-360 (2015).
  6. Wang, Z., et al. Autophagy mediated CoCrMo particle-induced peri-implant osteolysis by promoting osteoblast apoptosis. Autophagy. 11 (12), 2358-2369 (2015).
  7. Wang, R., et al. Particle-induced osteolysis mediated by endoplasmic reticulum stress in prosthesis loosening. Biomaterials. 34 (11), 2611-2623 (2013).
  8. Yang, S. Y., et al. Adeno-associated virus-mediated osteoprotegerin gene transfer protects against particulate polyethylene-induced osteolysis in a murine model. Arthritis Rheum. 46 (9), 2514-2523 (2002).
  9. Liu, N., et al. Autophagy mediated TiAl(6)V(4) particle-induced peri-implant osteolysis by promoting expression of TNF-alpha. Biochem Biophys Res Commun. 473 (1), 133-139 (2016).
  10. Wang, Z., et al. ER Stress Mediates TiAl6V4 Particle-Induced Peri-Implant Osteolysis by Promoting RANKL Expression in Fibroblasts. PLoS One. 10 (9), e0137774 (2015).
  11. Wang, Z., et al. TiAl6V4 particles promote osteoclast formation via autophagy-mediated downregulation of interferon-beta in osteocytes. Acta Biomater. 48, 489-498 (2017).
  12. Chen, S., et al. Lycorine suppresses RANKL-induced osteoclastogenesis in vitro and prevents ovariectomy-induced osteoporosis and titanium particle-induced osteolysis in vivo. Sci Rep. 5, 12853 (2015).
  13. Neuerburg, C., et al. The role of calcitonin receptor signalling in polyethylene particle-induced osteolysis. Acta Biomater. 14, 125-132 (2015).
  14. Catelas, I., Jacobs, J. J. Biologic activity of wear particles. Instr Course Lect. 59, 3-16 (2010).
  15. Liu, A., et al. The biological response to nanometre-sized polymer particles. Acta Biomater. 23, 38-51 (2015).
check_url/pt/56276?article_type=t

Play Video

Citar este artigo
Jiang, H., Wang, Y., Deng, Z., Jin, J., Meng, J., Chen, S., Wang, J., Qiu, Y., Guo, T., Zhao, J. Construction and Evaluation of a Murine Calvarial Osteolysis Model by Exposure to CoCrMo Particles in Aseptic Loosening. J. Vis. Exp. (132), e56276, doi:10.3791/56276 (2018).

View Video