Forbedret metoden for etablering av en In Vitro blod - hjerne barrieren modell basert på svin hjernen endotelceller

Summary

Målet med protokollen er å presentere en optimalisert prosedyre for etablering av en i vitro blod – hjerne barrieren (BBB) modell basert på primære svin hjernen endotelceller (pBECs). Modellen viser høy reproduserbarhet, høy tetthet, og er egnet for studier av transport og intracellulær menneskehandel i stoffet funnet.

Abstract

Målet med denne protokollen presenterer en optimalisert prosedyre for rensing og dyrking av pBECs og i vitro blod – hjerne barrieren (BBB) modeller basert på pBECs i mono-kultur (MC), MC med astrocytter-conditioned medium (ACM), og ikke-kontakt co kultur (NCC) med astrocyttene av svin eller rotte opprinnelse. pBECs ble isolert og kultivert fra fragmenter av kapillærer fra hjernen halvdelene av innenlandske griser 5-6 måneder gammel. Disse fragmentene ble renset ved forsiktig fjerning av meninges, isolasjon og homogenisering av grå materie, filtrering, enzymatisk fordøyelsen og sentrifugering. For å ytterligere eliminere skadelige celler, kapillære fragmenter ble kultivert med puromycin som inneholder mediet. Når 60-95% confluent, pBECs fra kapillær fragmenter ble passaged til gjennomtrengelig membran filter setter inn og etablerte modeller. For å øke barriere tetthet og BBB karakteristiske fenotypen av pBECs, cellene ble behandlet med følgende differensiering faktorer: membran permeant 8-CPT-cAMP (her forkortet cAMP), hydrocortisone og en fosfodiesterase inhibitor, RO-20-1724 (RO). Prosedyren ble utført over en periode på 9-11 dager, og når etablerende NCC modellen, astrocyttene ble kultivert 2-8 uker i forveien. Overholdelse av beskrevet prosedyrene i protokollen har tillatt etableringen av endothelial lag med svært begrenset paracellular permeabilitet, med NCC modell viser en gjennomsnittet transendothelial motstand (TEER) 1249 ± 80 Ω cm ², og paracellular permeabilitet (P_app) for Lucifer gule av 0,90 10^-6 ± 0,13 10^-6 cm sek^-1 (mener ± SEM, n = 55). Videre evaluering av denne pBEC fenotypen viste godt uttrykk for tett junctional proteiner claudin 5, ZO-1, occludin og adherens krysset protein p120 catenin. Modellen presentert kan brukes for en rekke studier av BBB i helse og sykdom, og med svært restriktive paracellular permeabilitet, denne modellen er egnet for studier av transport og intracellulær menneskehandel.

Introduction

Mobilnettet strukturen og funksjonen til blod – hjerne barrieren

På grensesnittet av sirkulasjons og sentrale nervesystemet (CNS) fungerer BBB som viktige forskrifter nettsted for homoeostatic kontroll over CNS-microenvironment som er avgjørende for riktig funksjon og beskyttelse av nervesystemet. Stedet for BBB er endotelceller foring på blod fartøy lumen. I hjerne blodkar, endotelceller form komplekse intercellulære stramt veikryss og sterkt polarisert uttrykk mønstre av bestemt tilstrømningen og middelklasseinnbyggere transportører sikre svært spesifikke molekylær transport mellom blod og hjernen ¹. Strukturelle komponenter i tett krysset komplekser inkluderer proteiner fra occludin og claudin, zonula occludens (ZO) proteiner, cingulin og tilknyttede junctional vedheft molekyler (syltetøy). Claudin 5 er spesielt viktig i paracellular junctional begrensning. Induksjon og vedlikehold av denne karakteristiske BBB endothelial fenotypen involverer dynamisk samspill med omkringliggende celler, inkludert pericytes, astrocyttene, nerveceller og kjelleren membraner, som sammen med hjernen endothelial celler skjemaet i nevrovaskulære enhet (NVU)^2,3. Mekanismene som er involvert i disse samhandlingene er ennå ikke fullt ut forstått, men inkluderer utveksling av kjemiske signaler mellom cellene, som tillater modulering av BBB permeabilitet på kort sikt og induserer langsiktige BBB funksjoner⁴. Astrocyttene spesielt er kjent for å bidra til hjernen endothelial celle fenotypen og er en kilde til regulatoriske forhold som glial-avledet nevrotropisk faktor (påvirke intracellulær leiren)⁵, grunnleggende fibroblast vekstfaktor⁶, Hydrocortisone⁷og transformere vekstfaktor β (TGF-β)⁸. Effekten av TGF-β, men har vært omdiskutert⁹.

Fra i Vivo In Vitro BBB

I vivo studier fortsette å gi verdifull informasjon om BBB biologi. Men kan cellen kultur modeller gi ytterligere innsikt og utgjør nyttige verktøy for å forstå detaljert molekylære og funksjonelle aspekter av BBB i både helse og sykdom. Selv om de komplekse interaksjonene mellom celletyper og bestanddeler av BBB er vanskelig å fullt oppnå i vitro modeller, har det vært, siden første rensing av hjernen endotelceller og anvendelse av disse i mono-kulturer ^{10 , 11 , 12}, av rensing prosedyrer og vekst ansettelsesbetingelser BBB celle kultur modeller, som resulterer i større likhet med Gaspar i vivo barrieren. De brukte i vitro BBB modellene er basert på primær celler gnager, svin og bovin opprinnelse og udødeliggjort linjer. Hver modell har forskjellige fordeler og ulemper. For sammenligning og modell valg brukes validering markører som uttrykk for BBB enzymer, transportører, reseptorer og strukturelle proteiner til å opprette oversikter av gjeldende etablerte modeller¹.

Formålet med protokollen

En viktig funksjon i BBB er barriere tetthet og høy TEER, men mange av de tilgjengelige modellene reflekterer ikke godt i vivo nivåene. Innlemme utvikling og optimalisering bidrag fra flere laboratorier, er målet med denne protokollen å presentere en metode for å opprette en høy TEER i vitro BBB modell basert på primære pBECs MC med eller uten ACM eller NCC med primær astrocyttene rotte eller svin opprinnelse. Anvendt prosedyrer og etableringen av modellen inkluderer innsats å eliminere skadelige celler og forbedre differensiering av pBECs i en BBB fenotypen. Dette arbeidet har resultert i etableringen av pålitelig, høy TEER modeller med lav paracellular permeabilitet og god funksjonelle uttrykk for viktige stram junctional proteiner, transportører og reseptorer. Men som astrocyttene er en medvirkende faktor til hjernen endothelial celle fenotypen, representerer i tre ulike betingelser kultur tre Norge av hjernen endotelceller. NCC modellen er spesielt nyttig for studier av enkelte spesialiserte mekanismer involvert i stoffet funnet, transport studier og intracellulær menneskehandel, og etterforskning av celle-celle interaksjoner der maksimal uttrykk BBB funksjoner er fordelaktig.

Opprinnelsen og historien til protokollen

Den pBEC modellen beskrevet her er hovedsakelig basert på porcine modell utviklet ved Eisai Laboratories (London) av Dr. Louise Morgan og kolleger, whichis basert på en vellykket tidligere bovin hjernen endothelial celle modell¹³. Den opprinnelige metoden celle forberedelser var en to-trinns filtrering bruker nylon maskene for å fange microvessels, etterfulgt av et subculturing skritt for å forbedre renhet. I tidligere utvikling av metoden, optimal BBB fenotypen og barriere tetthet ble oppnådd ved vekst i supplert medium, inkludert ACM. Ytterligere modifiseringer å metoden ble gjort av R. Skinner i Prof N. Rothwell lab i Manchester UK^14,15. Metoden ble innført av Abbott laboratoriet, KCL London, hvor Patabendige gjorde det betraktelig enklere å forberede ved å unngå bruk av astrocyttene eller ACM og eliminere skadelige celler som pericytes med puromycin. Første avisene bekreftet at MC modellen bevart flere viktige funksjoner av i vivo BBB, inkludert effektive stramt veikryss, membran transportsystemer og reseptor-mediert transcytosis^{16,17 , 18 , 19 , 20}. senere S. komme igjen testet astrocytter co kultur og funnet det forbedret TEER, så dette er den foretrukne varianten som brukes i Abbott lab²¹. Modellen har nå blitt overført til M. Nielsen lab i Århus, hvor ytterligere modifiseringer ha blitt introdusert (dette protocol), inkludert forenkle grå rolle utvinning, bruker bare ett nett filtrering trinn, og en enkelt filter belegg kombinere kollagen og fibronectin. Bruk fremgangsmåten for isolering av svin astrocyttene (denne protokollen) var basert på protokoller utviklet av T. Moos laboratoriet i Aalborg, beskrevet av Thomsen et al²². TEER og andre egenskaper for modellen generert i London og Århus er lik, som gir tillit til forestillingen om at modellen er lett overføres mellom laboratorier og svarer godt til forsiktig observasjon og rasjonalisere trinn. Faktisk, S. PPLive nå etablert MC-modell i et tropisk land (Malaysia)²³, som involverte ytterligere justering for lokal betingelser og vev kilder.

Fordelene over alternativ metoder og nå etablert modeller

PBECs sammenlignet med hjernen endotelceller av storfe og gnager opprinnelse, og gir fordelen av å ha en lavere pris for tap av i vivo BBB fenotypen etter isolasjon²⁴. Videre er pBECs stand til å danne relativt stramt endothelial barrierer, selv når dyrket i MC (800 Ω cm²)¹⁶ sammenlignet med vanlig rapporterte nivåene for monolayers av cellelinjer som bEND.5 og bEND.3 (50 Ω cm²) ^{25 , 26 , 27}, ende (300-800 Ω cm²)^28,29,30, og cerebEND (500 Ω cm²)^29,31,32og primære hjernen endotelceller mus (100-300 Ω cm²)ss = “xref” > 33^,34,35,36 og rotten (100-300 Ω cm²)^37,38. TEER har imidlertid vist avhengighet på rensing og kultur prosedyrene. I de fleste tilfeller viser tillegg av ACM eller co kultur med astrocyttene unike effekter på endotelceller og en økning i tetthet av endothelial lag¹. Likevel med arbeid med å optimalisere culturing forholdene, bare storfe-baserte modeller har vist TEER verdier sammenlignes med svin-baserte modeller (gjennomsnitt 800 Ω cm² i MC, opp til 2500 Ω cm² i astrocytter co kultur)^{13 ,39,40,41,42,43,44,45}. Som modeller basert på primære bovin hjernen har endotelceller vist store variasjoner, både mellom og innenfor laboratorier^{14,45,46,47,48}, reproduserbarhet kan være et problem. I pBEC modell rapporterte her, har bidrar laboratoriene oppnådd svært lik TEER og paracellular permeabilitet verdier med lav variasjon, både i og mellom laboratorier. Derfor bør det være mulig for andre laboratorier for å etablere en robust modell med lave variasjon med metoden presenteres her. I tillegg danner stramt endothelial lag, har modeller med pBECs tidligere blitt godkjent av uttrykk for tett krysset proteiner, funksjonelle BBB transportører, reseptorer og enzymer og demonstrerte egnethet for en rekke studier^{15 , 16 , 17 , 19 , 20 , 22 , 49 , 50 , 51 , 52 , 53 , 54 , 55 , 56 , 57 , 58 , 59}. videre upubliserte transcriptome data på co kulturer av pBECs viser en forventet profil av BBB transportører og reseptorer (upubliserte resultater, Nielsen et al.).

Den svin-baserte BBB modellen har flere fordeler som genom, anatomi, fysiologi, og sykdomsprogresjon av grisen gjenspeile menneskets biologi i større grad enn andre etablerte modeller har⁶⁰, som er gunstig for den farmasøytisk industri. Som svin hjernen er et vanlig biprodukt av kjøttet industrien, utgjør de en lett tilgjengelig kilde til hjernen endotelceller, minimere antall dyr trengte eksperimenter, og gir en høy rensing avkastning fra én svin hjerne. Selv om rensing og dyrking av primære celler er litt tidkrevende og krever kompetanse for standardisering i å sette opp modellen, generere primære celler mest pålitelige BBB modellene. Udødeliggjort cellelinjer kan ikke være en erstatning, som viktige egenskaper som barriere tetthet, transporter uttrykket profiler og microenvironment regulering ikke reflekterer eksperimentelle resultatene i vivo^{61, 62}. in vitro modeller gir fordelen av live-celle tenkelig med høyere oppløsning, gjør visualisering av intracellulær prosesser mulig ved at en nærhet tilnærming til samplet eller observert cellene, bruker mål med høyere forstørrelse og bedre optisk kvalitet⁶³. Dette er ikke tilfelle for bruk av to-fotonet mikroskopi i levende dyr. Videre gir i vitro modeller muligheten til å transfect celler, slik at visualisering av merket proteiner og undersøkelse av deres handel.

Anvendelser av modellen

Funksjonen til BBB er ikke fast, og kan være dynamisk modulert både fysiologi og patologi. I mange nevrologiske sykdommer, inkludert nevrodegenerative, er provoserende og smittsomme sykdommer, avbrudd og økt permeabilitet av BBB observert^64,65,66,67 . For å redusere og forebygge sykdomsprogresjon og påfølgende skade, er identifikasjon og karakterisering av molekylære mekanismer underliggende modulering av BBB av stor betydning. I denne sammenheng, pålitelig i vitro modeller er i høy etterspørsel av legemiddelindustrien, og videre spille viktige roller i å forutsi BBB permeabilitet av narkotika til CNS. Noen i vitro modell som en permeabilitet skjerm skal vise en restriktiv paracellular sti, fysiologisk realistisk celle arkitektur og funksjonelle uttrykk for transporter mekanismer⁶⁸. Vist i tidligere studier^16,17,57og paracellular permeabilitet og uttrykk for TJ og AJ proteiner her, presentert modellen oppfyller alle disse kriteriene og er egnet for en rekke av BBB studier i både normale fysiologi og patologi. Styrke av presentert rensing og dyrking metoden er en kombinasjon av enkelhet og reproduserbarhet og evnen å inkludere astrocytic innflytelse med resulterende robust og pålitelig høy TEER i vitro BBB modell. For dette formål, astrocyttene av svin og rotte opprinnelse har vist seg å øke BBB fenotypen av pBECs i en lignende måte²².

Protocol

svin hjernen ble innhentet som biprodukter av danske næringsmiddelindustrien. Danske slakterier er under strengt oppsyn og observasjon av danske Miljøverndepartementet og mat. rotter brukes for isolering av astrocyttene ble avlet og gruppe plassert i lokale dyr anlegget ved en omgivelsestemperatur på 22 ° C – 23 ° C og en 12/12 h mørke/lys syklus under inspeksjon av veterinær og ifølge dansk regler for lab dyr. Rotter var euthanized før de ble ofret i samsvar med internasjonale retn…

Representative Results

Etablering av BBB In Vitro modeller I metoden presentert, optimalisert ble dyrking av pBECs og etablering av gjennomtrengelig membran sett inn systemet med MC eller uten ACM eller NCC med astrocyttene (figur 1) gjennomført i en periode på 9-11 dager (figur 2). Utvalg av endotelceller, en innledende kultur av renset kapillær fragmenter ble kombinert med puromyci…

Discussion

Rensing og spredning av pBEC

Under den rensing prosedyren er avgjørende skritt rask og effektiv fjerning av meninges og separasjon av hvite og grå materie, som er viktig for rensing avkastning og renhet og for riktig etableringen av modellen. Presentert i vitro BBB modellen med pBECs, har vi forbedret og forenklet en rensing prosedyren basert på mekanisk homogenisering av isolerte grå materie, størrelse-selektiv filtrering for isolering av microvessels, fordøyelsen med collagenase …

Materials

Fibronectin	Sigma-Aldrich	F1141
Collagen IV	Sigma-Aldrich	C5533
Poly-L-lysine	Sigma-Aldrich	P1524
DMEM/F-12	Lonza	BE12-719F
DMEM/Low Glucose	Sigma-Aldrich	D6046
Penicillin/Streptomycin	Gibco Invitrogen	15140
Plasma derived serum (PDS)	First Link UK Ltd.	60-00-89
Fetal bovine serum (FBS)	Gibco Invitrogen	10-270-106
Trypsin/EDTA	Gibco Invitrogen	15090-046
Heparin	Sigma-Aldrich	H3393
Puromycin	Sigma-Aldrich	P8833
Hydrocortisone	Sigma-Aldrich	H4001
8-CPT-cAMP	Biolog	C010
RO 20-1724	Sigma-Aldrich	B8279
Gentamicin Sulfate	Lonza	17-518Z
DMSO	Sigma-Aldrich	34896
PBS	Sigma-Aldrich	D8537
EtOH	VWR	20,824,296	Mix the 70 % solution from the 96 % EtOH
DNAse 1	Sigma-Aldrich	D4513
Collagenase CLS2	Sigma-Aldrich	C6885
ddH2O			Made with Elga System
T75 flasks	Thermo Scientific	156499
Costar Transwell inserts (Cell permeable membrane inserts)	Costar	CLS3401	12-well plate, 12 mm diameter, 0.4 μm polycarbonate membrane
15 ml centrifuge tubes	Cellstar	188271
50 ml centrifuge tubes	Cellstar	227261
Petri dishes	Thermo Scientific	150350
Cryo vials	Thermo Scientific	377224
500 ml bottle	Thermo Scientific	159910/159920
Scalpels	Swann-Morten	REF0211	Type 24
Tissue homogenizer	Sigma	D9188
140 μm filters	MERCK	NY4H04700
40 μm filters	Corning	431750
EndOhm chamber system	World Precision Instruments	ENDOHM-12	EndOhm chamber for 12mm Culture Cups
EVOM2 electrode system	World Precision Instruments	300523+STX100C	TEER measurement system with rigid STX-100C electrode pair
Long needle	Sigma		Attach to a syringe
Fine-tip curved forceps	KLS Martin	12-409-12-07
Broad tip forceps	VWR	82027-390
Filter holder	MERCK Milipore	Swinnex-47
50 ml syringe	Braun	4617509F
10 ml syringe	Terumo	SSt20ESI
Anti-Occludin antibody	Abcam	ab31721	1:100
Anti-p120 Catenin antibody	BD Transduction laboratories	610133	1:200
Anti-ZO-1 antibody	Invitrogen	61-7300	1:200
Anti-Claudin 5 antibody	Sigma-Aldrich	SAB4502981	1:100
Donkey anti rabbit IgG conjugated with Alexa Flour 568	Thermo Scientific	A10042	1:500
Donkey anti mouse IgG conjugated with Alexa Flour 488	Thermo Scientific	A21202	1:500
Sucrose	Perkin Elmer	NEC100X250UC	0.15µl/ml final working conc
Lucifer Yellow	Sigma	L0144	10 µg/ml final working conc