Incompatibilidades em sequências de antigénios (HLA) leucocitário humano entre doador e beneficiários pares são a principal causa de rejeição mediada por anticorpo em transplante de órgãos. Aqui nós apresentamos o uso de matrizes de antígeno personalizado com base em sequências HLA dos doadores individuais para sondar aloanticorpos HLA antidoadores em receptores de órgãos.
É necessária uma assinatura do JoVE para visualizar este conteúdo. Faça login ou inicie seu teste gratuito.
Artigo de método
Personalizado do Peptide matrizes para a deteção de aloanticorpos HLA no transplante de órgãos
Neste artigo
Resumo
Resumo
No transplante de órgãos, a função e a longevidade da prótese criticamente dependem do sucesso de controlar a reatividade de rejeição imunológica contra antígenos de leucócitos humanos (HLA). Diretrizes de histocompatibilidade são baseadas em testes laboratoriais de imunidade anti-HLA, que apresenta como pré-existentes ou de novo gerados anticorpos HLA que constituem uma barreira grande transplante. Testes atuais estão construídos sobre uma plataforma de grânulos single-antigénio (SAB) usando um conjunto fixo de ~ 100 pré-selecionados antígenos HLA para transplante soros de sonda. No entanto, em humanos, existem uma variedade muito maior de tipos HLA, com nenhum dois indivíduos que não sejam gêmeos idênticos que podem compartilhar a mesma combinação de sequências HLA. Enquanto tecnologias avançadas para a tipagem de HLA e sequenciamento direto precisamente podem capturar qualquer inadequações na sequência de DNA entre um doador e HLA do receptor, o ensaio de ORS, devido à sua variedade limitada em representação de sequência, é incapaz de detectar precisamente aloanticorpos especificamente contra o doador HLA mismatches. Procuramos desenvolver um método complementar, usando uma tecnologia diferente para detectar e caracterizar os anticorpos HLA de antiem doadores uma base personalizada. A ferramenta de seleção é uma matriz de peptídeo personalizado doador HLA-derivado de sequências de para sondar pós-transplante soros do destinatário órgão para avaliar o risco de rejeição mediada por anticorpo. Em um único array para um par de doador-beneficiário, até 600 exclusivos peptídeos são feitas com base em sequências de proteínas HLA do doador, cada peptídeo carregando pelo menos um resíduo incompatível em uma sequência de ácido amino-15. Em nossos experimentos piloto para comparar padrões de antígeno do pré e pós transplante sera nesses conjuntos, fomos capazes de detectar sinais de anti-HLA com a resolução que também nos permitiu identificar os epítopos imunes envolvidos. Estas personalizado matrizes de antígeno permitam a detecção de alta resolução de epitopos HLA do doador específico em transplante de órgãos.
Introdução
Terapia de substituição de órgão que é rotineiramente realizada em todo o mundo já salvou milhões de vidas. Transplantação de órgãos sólidos ocorre em cerca de 100 pacientes por milhão de pessoas nos Estados Unidos anualmente, ao passo que um número maior ainda colocorá receber órgãos de doadores devido a uma grave escassez de abastecimento (de acordo com informações fornecidas pelo órgão Colheita e transplante de rede - OPTN/UNOS: optn.transplant.hrsa.gov). Transplante de órgãos é altamente regulada a fim de reduzir o desperdício de órgãos e salvar vidas, mas as ferramentas científicas usadas para informar a estes regulamentos são limitadas na eficácia. Por exemplo, ....
Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.
Protocolo
Todos os métodos descritos aqui foram aprovados pelo noroeste da Universidade institucional Review Board (IRB protocolo #: STU00104680). Um fluxo de trabalho geral do protocolo é ilustrado na Figura 1.
1. a análise de Bioinformatic do doador e receptor HLA sequências
- recuperar sequências de banco de dados IMGT/HLA 15.
- Relatórios de digitação obter HLA do doador de órgãos e do seu receptor.
Nota: Certifique-se de procedimentos adequados para proteger os registos médicos confidenciais são utilizados. Normalmente, uma aprovação institucional Review Board (IRB), o p....
- Relatórios de digitação obter HLA do doador de órgãos e do seu receptor.
Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.
Resultados
No estudo original usando a matriz de seleção método17, estamos inscritos um total de 5 indivíduos de transplante de rim. Obtivemos o HLA digitando resultados de nossa coorte e de seus respectivos doadores. Sua história médica e anticorpos alélica de SAB testes também estavam disponíveis para nós. Em nosso estudo piloto desses 5 pacientes, criámos duas metodologias diferentes: um matriz padrão, composto por um painel fixo de peptídeos e matrizes personalizados que .......
Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.
Discussão
O desenho da matriz de ponto descrito aqui é para o estudo experimental de especificidade de Alo-anticorpo em transplante contra antígenos HLA do doador de órgãos. Em contraste com o ensaio SAB existente, amplamente utilizado na clínica, o método de matriz de antígeno tem uma grande vantagem em seu design flexível que pode acomodar as verdadeiras sequências HLA do doador individual. A nova plataforma explora os potenciais da tecnologia de sequenciamento de DNA rapidamente avançando que em breve será capaz de produzir lei.......
Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.
Divulgações
Não há conflitos de interesses declararam.
Agradecimentos
Agradecemos os Drs Shawn Li e Li Xing de Western University, no Canadá por sua gentil assistência com mancha matriz de produção. Somos gratos aos membros do pessoal no núcleo histocompatibilidade e abrangente de transplante centro do noroeste da Universidade para a prestação de serviços de exemplo. Este trabalho foi parcialmente apoiado pelo auxiliar placa de Northwestern Memorial Hospital e por um fundo de inicialização faculdade fornecido pela Northwestern University a JJ.
....Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.
Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Matriz de peptídeos | INTAVIS Bioanalytical Instruments | ||
| Etanol | Sigma-Aldrich | E7023 | |
| Solução Ponceau S | Sigma-Aldrich | P7170 | |
| Leite desnatado | Bio Rad Laboratories | 1706404 | |
| TBST | Santa Cruz Biotechnology | 10711454001 | |
| IgG anti-humano de cabra– HRP | ThermoFisher Scientific | A18811 | |
| Clarity Western ECL Substrate | Bio Rad Laboratories | 1705061 | |
| Restore Western Blot Stripping Buffer | Thermo Scientifics | 21059 | |
| ChemiDoc Bio | Rad Laboratories | 1708265 |
Referências
- Bradshaw, R. A., Dunn, P. P. Unambiguous high resolution genotyping of human leukocyte antigens. J Immunol Methods. , (2017).
- Robinson, J., Halliwell, J. A., McWilliam, H., Lopez, R., Marsh, S. G. IPD--the Immuno Polymorphism Database. Nucleic Acids Res. 41, D1234-D1240 (2013).
- Tait, B. D.
Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.
Reimpressões e permissões
