当前的协议描述了一种方法, 用户可以在收集磁共振显微镜数据的过程中维持急性海马和皮质切片准备工作的可行性。
本议定书描述的程序, 以支持正常代谢功能的急性脑切片准备在收集磁共振 (MR) 显微镜数据。虽然有可能执行 MR 收集活体, 切除哺乳动物组织, 这样的实验传统上受到限制的分辨率限制, 因此无法可视化组织显微结构。相反, 实现了显微图像分辨率的 MR 协议需要使用固定的样本来满足在冗长的扫描时间内静态、不变的条件的需要。当前的协议描述了第一个可用的 mr 技术, 它能够在显微镜分辨率下对活体、哺乳动物组织样本进行成像。这类数据对于理解微观层面的 pathology-based 对比变化如何影响宏观 MR 扫描的内容, 如临床中使用的, 具有重要意义。一旦认识到这一点, 就可以发展出更灵敏和更准确的诊断方法, 这将直接转化为早期疾病治疗、更准确的治疗监测和改善患者结局。
虽然所描述的方法侧重于脑切片的准备, 该协议适用于任何切除组织切片, 因为改变了气体和液的准备, 以适应组织的特定代谢需要。该协议的成功执行应导致生活, 急性切片准备, 展示 mr 扩散信号稳定的时间长达15.5 小时。目前的系统的主要优势, 其他 mr 兼容灌注设备是它与 mr 显微镜硬件的兼容性, 以获得更高的分辨率图像和能力提供恒定的, 不间断的流动, 仔细规范的液条件。减少样本吞吐量是这个设计的考虑因素, 因为一次只有一个组织切片可以成像。
由于磁共振成像 (MRI) 系统已稳步发展到越来越高的场强, 更多的细节有关的组成和状态的活体组织已成为可辨。尽管有这样的硬件进展, 磁共振成像在分辨率足以可视化组织细胞结构仍然没有在诊所。因此, 在考虑临床扫描的内容时, 必须推断组织的细胞水平特征。这种推断需要了解从模型系统中所采集的数据中收集到的等价过程, 可以直接观察到。传统上, 这些模型包括来自水生生物的细胞, 如爪蟾的卵细胞和兔 californica L7 神经元1,2。这些是第一个动物细胞, 可供观察与 MR 方法, 由于其超大尺寸: 约1000μ m 和300微米直径, 分别。最近, 硬件设计的进步使得哺乳动物细胞的一个最大的例子-α-运动神经元-将使用 MR 显微镜技术在固定组织上成像3,4。虽然这些研究表明使用 mr 直接可视化哺乳动物的细胞材料, 这些固定样本在其 mr 特性中有很大的不同, 因此不能作为等效的代表性模型5, 6。更重要的是, 观察与复杂的生物过程相结合的 mr 对比变化需要活体样本, 在成像实验过程中可以被摄动和测量。
为方便 mr 显微镜对活体组织的研究, 提出了一个协议, 其中包括商业显微硬件7接口的 purpose-built, MR 兼容, 内径氧和灌注装置以前所描述的8.这种设计的独特优势包括哺乳动物组织中的细胞级分辨能力, 以及在组织灌注部位对溶解气体含量和 pH 值的精确控制。此外, 与大多数的外植体 MR 研究, 中断灌注在图像采集, 以避免流动文物, 这种设计支持使用连续灌注的数据收集, 已表明, 以改善生理状况分离的组织9,10。最后, 它的闭合记录室和切片保留硬件帮助减少可能发生在长时间的图像收集过程中的运动工件的可能性。
虽然当前的协议描述了适用于急性海马和皮质切片的程序, 但对液代谢物的精确控制使这个系统能够容纳各种各样的组织类型和实验条件。此设计的局限性包括与多层灌注室11相比, 样品吞吐量降低;但是, 在将来使用 multi-coil 数组时, 此限制可能会被克服。
此外, 虽然所描述的系统可以在水平或垂直配置中使用, 但当前协议的特点是它在垂直定向的 600 MHz 光谱仪中的应用。任何能够进行 MR 显微研究的系统–通常是窄孔 (6 厘米)、高场强 (≥500 MHz) 光谱仪–都将容纳所描述的氧和灌注设备。但是, 对成像线圈、渐变、探头系统或其他必需的成像硬件的更改可能需要改变灌注设备和 mr 扫描参数。
目前的协议描述了必要的程序, 标准代谢维护的急性脑切片准备接受磁共振显微镜。这个过程是目前唯一可用的方法, 它能使活体哺乳动物组织与 MR 在解决细胞的分辨率上可视化。虽然描述的液条件是专门针对中枢神经系统组织, 该协议是广泛适用于任何方式的活组织准备通过调整的液和气体成分以及灌注流速和温度。
在描述的过程中可能遇到的最常见的问题包括那些与代谢物供应的失败有关。由于碳酸氢盐缓冲系统的失效, 在气态不足时, 钙盐的沉淀可能发生在 aCSF 内。这种沉淀物会堵塞灌注管线, 造成严重的硬件损坏。如果在探针组装后的液中观察到盐沉淀物, 请立即关闭蠕动泵, 停止灌流。确认存在足够的碳酸氢钠水平 (4.37 克/2 升) 在液, CO2级 (5.0%) 的供应气体, 和卡波金气体流量 (1/16 升/分钟) 到两个水库和氧。最后, 确定 pH 水平在生理范围内 (7.3-7.4) 稳定。如果氧气和 pH 值仍未适当调节, 应更换气体交换膜。
如果切片在预期的实验时效上不显示信号稳定性, 请确认 aCSF 混合物中存在正确的化学成分, 并且保持正确的渗透 (300 mOsm) 和 pH 值 (7.3-7.4)。此外, 确保卡波金天然气供应到液水库和氧在1/16 升/分钟。如果这些步骤不正确的液条件, 更换气体交换膜建议。如果在排除液条件后组织稳定性不达标, 应考虑手术方案的细化, 重点是尽量减少组织收获和灌注应用之间的时间间隔。
The authors have nothing to disclose.
这项工作得到了国家卫生研究院 (1R21NS094061-01A1) (NIH 1R01EB012874-01) (S10RR031637) 和国家科学基金会 (合作协议 No.) 的资助。DMR-1157490) 通过国家高磁场实验室 (NHMFL) 先进的磁共振成像和光谱学 (序号) 设施在 UF 和佛罗里达州。
Perfusate Preparation | |||
Osmette A | Precision Systems Inc. | 5002 | freezing point depression osmometer |
Stir Plate Type 1000 | Barnstead/Thermodyne | SPA1025B | magnetic stir plate with heating element |
Accumet Basic pH Meter | Fisher Scientific | AB15 | pH Meter |
pH Probe | Fisher Scientific | 13-620-AP61 | probe for pH measurement |
Oxygen Meter | Microelectrodes Inc. | OM-4 | meter for sampling the oxygen content of gasses or the disolved oxygen content of liquid perfusates |
Oxygen Electrode | Microelectrodes Inc. | MI-730 | microprobe for the oxygen meter |
Scale | Denver Instrument Co. | A-160 | microscale for weighing chemical components |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Slice Preparation | |||
Lancer Vibratome | Ted Pella Inc. | Series 1000 | vibratory tissue slicer |
Disecting Microscope | Carl Zeiss Inc. | OPMI 1-FC | tabletop, binocular disecting microscope |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Perfusion System | |||
Masterflex L/S | Cole-Parmer | 7523-50 | peristaltic micro perfusion pump |
Oxygen Regulators x 2 | Victor Medical | VMG-05LY | device for regulating gas flow |
e-sized carbogen cylinders x 2 | Airgas | gas tanks containing carbogen gas | |
in-bore oxygenator | developed in house | device responsible for pH and oxygen regulation in the perfusate | |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
MR Imaging Hardware | |||
Micro Surface Coil (200mm dia., modified) | Bruker Biospin | B6371/0001 | four-turn micro (200mm dia) surface-style radiofrequency coil |
Micro 5 probe body | Bruker Biospin | Z3395 | microimaging probe used in the 600 MHz spectrometer |
Micro 5 gradient coils | Bruker Biospin | M81111 | gradient coil stack used with micro 5 probe body |
600 MHz Spectrometer | Oxford Instruments | superconducting magnet (14.1T) used for MR image generation | |
Imaging Console | Bruker Biospin | Avance III | support and control hardware including gradient amplifiers, preamps, & workstation used for MR image generation |
Air Blower | Bruker Biospin | BCU-II, -80/60 | Air chiller unit used in conjunction with the probe's heating coil to regulate temperature inside the magnet bore |
Gradient Chiller | Thermo Scientific | Neslab Merlin M33 | Water chiller used to disipate heat generated by the gradient coils |