यह तकनीक बैक्टीरिया का मूल्यांकन करने के लिए एक कुशल स्क्रीनिंग प्रक्रिया का वर्णन-विशिष्ट ऑप्टिकल इमेजिंग एजेंटों के भीतर पूर्व vivo मानव फेफड़ों के ऊतकों, फाइबर द्वारा छोटे अणु रासायनिक की तेजी से पहचान के लिए फोकल प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी द्वारा जांच-अनुवाद क्षमता के साथ उंमीदवारों ।
गति और बैक्टीरियल पता लगाने की सटीकता में सुधार रोगी स्तरीकरण के लिए महत्वपूर्ण है और रोगाणुरोधी के उचित उपयोग सुनिश्चित करने के लिए. इस लक्ष्य को प्राप्त करने के लिए, नैदानिक तकनीक के विकास के बिंदु पर वास्तविक समय में बैक्टीरियल उपस्थिति की पहचान करने के लिए देखभाल की आवश्यकता है । मेजबान के भीतर बैक्टीरिया की प्रत्यक्ष पहचान के लिए ऑप्टिकल इमेजिंग एक आकर्षक दृष्टिकोण है । रासायनिक जांच डिजाइन और सत्यापन में कई प्रयास की जांच की गई है, लेकिन कोई भी अभी तक सफलतापूर्वक क्लिनिक में अनुवाद किया गया है । यहां हम बैक्टीरिया की पहचान के लिए एक विधि के पूर्व vivo सत्यापन के लिए बाहर फेफड़े के भीतर बैक्टीरिया विशिष्ट जांच का वर्णन, फाइबर्ड फोकल प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी (FCFM) द्वारा imaged । हमारे मॉडल पूर्व vivo मानव फेफड़े के ऊतकों और एक नैदानिक अनुमोदित फोकल लेजर endomicroscopy (CLE) मंच उपन्यास बैक्टीरिया-विशिष्ट इमेजिंग यौगिकों, बारीकी से रोगियों के साथ सामना किया जा करने के लिए अपेक्षित इमेजिंग शर्तों की नकल की स्क्रीन करने के लिए इस्तेमाल किया । इसलिए, इस तकनीक के द्वारा स्क्रीनिंग यौगिकों संभावित नैदानिक पथ का विश्वास प्रदान करता है ।
इस तकनीक में बैक्टीरिया का मूल्यांकन करने के लिए एक तेजी से स्क्रीनिंग प्रक्रिया का वर्णन-विशिष्ट ऑप्टिकल इमेजिंग एजेंटों के भीतर पूर्व vivo CLE द्वारा मानव फेफड़े के ऊतकों के लिए संभावित नैदानिक उपयोगिता के साथ यौगिकों की तेजी से पहचान के लिए FCFM का उपयोग visualizing सीटू मेंबाहर फेफड़े में बैक्टीरिया ।
वहां एक अत्यावश्यक वैश्विक आवश्यकता है राशन रोगाणुरोधी बढ़ती रोगाणुरोधी प्रतिरोध1के युग में विहित करने के लिए । इस अंत करने के लिए, नैदानिक तरीकों जो उच्च विशिष्टता, संवेदनशीलता के साथ बैक्टीरियल संक्रमण की पहचान करने के लिए कार्य के विकास, और वास्तविक समय में अत्यधिक2की मांग कर रहे हैं । वर्तमान तकनीक गंभीर रूप से ठीक रोगियों में निमोनिया के निदान की पुष्टि करने के लिए, ऐसे गहन देखभाल इकाइयों के भीतर उन (ICUs) के रूप में, अक्सर से बैक्टीरियल संस्कृति तकनीक के साथ गैर विशिष्ट नैदानिक या रेडियोलॉजिकल सुविधाओं की व्याख्या पर निर्भर aspirated द्रव/ऊतकों, जो परिणाम उत्पादन करने के लिए 3 दिन तक लग सकते हैं । इसके अलावा, तरल पदार्थ से बैक्टीरियल संस्कृति बाहर फेफड़े में जगाकर और पुनर्प्राप्त अधिक समीपस्थ एयरवेज3 से संक्रमण के लिए प्रवण है और अक्सर संस्कृति नकारात्मक सहवर्ती रोगाणुरोधी थेरेपी या गरीब नमूना तकनीक के कारण है । इसके अतिरिक्त, पोलीमरेज़ श्रृंखला प्रतिक्रिया के रूप में आणविक तकनीक पीढ़ी संवेदनशील होते हैं जब aspirated तरल पदार्थ पर इस्तेमाल किया, रोगियों के अधिक उपचार खतरे में डाल. एक उभरते नैदानिक दृष्टिकोण आणविक ऑप्टिकल इमेजिंग है, सीटू में बना ऊतकों की आणविक विकृति एक संभावना; हालांकि, ऑप्टिकल इमेजिंग यौगिकों के विकास और सत्यापन की आवश्यकता है । फिर भी, बैक्टीरिया के प्रत्यक्ष दृश्य, activatable ऑप्टिकल जांच के माध्यम से संभावित एक बहुत शक्तिशाली तरीका उपस्थिति और रोगी में निमोनिया के विकास के अध्ययन की अनुमति है, और महत्वपूर्ण बात, मेजबान के अध्ययन के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है-रोगज़नक़ में बातचीत सीटू में रीयल-टाइम में उपचारों की प्रतिक्रिया ।
CLE कई रोगों में एक स्थापित खोजी प्रक्रिया है4, गैस्ट्रोएंटरोलॉजी5, कैंसर विज्ञान6,7के क्षेत्रों के भीतर सहित, और एयरवेज और वायुकोशीय sacs8पूछताछ के लिए, 9. यह एक फाइबर इमेजिंग बंडल, जो एक नैदानिक एंडोस्कोप का काम कर चैनल के माध्यम से गुजरता है और ऊतक सतह के साथ सीधे संपर्क करने के लिए फोकल माइक्रोस्कोप द्वारा छवि के रूप में किया जाता है का उपयोग कर रोगग्रस्त ऊतक के बिंदु की देखभाल संरचनात्मक इमेजिंग सक्षम बनाता है । हालांकि, एक सीमा है कि सामांय कंट्रास्ट एजेंटों के लिए की जरूरत है । इसलिए, विशिष्ट बैक्टीरियल एजेंटों के रूप में रोग विशिष्ट जांच, का उपयोग काफी, सीधे संदिग्ध संक्रमण के स्थल पर बैक्टीरिया visualizing द्वारा इस रूपरेखा की उपयोगिता का विस्तार सकता है । ऑप्टिकल एजेंट वास्तविक समय, नैदानिक क्षमता के साथ उच्च संकल्प इमेजिंग को सक्षम करने के द्वारा अंय तकनीकों पर कई लाभ प्रदान करते हैं । इसके अलावा, ऑप्टिकल जांच कई ठिकानों से पूछताछ के लिए मल्टीप्लेक्स की संभावना प्रदान करती है, सभी अपेक्षाकृत कम लागत पर हासिल की । ऑप्टिकल एजेंटों के एक नंबर के विकास के तहत इस तरह के एक उद्देश्य के लिए कर रहे हैं, लेकिन कोई भी अभी तक सफलतापूर्वक क्लिनिक के भीतर लागू किया गया है10। हम बैक्टीरिया के प्रति विशिष्टता के साथ छोटे अणु रासायनिक जांच के एक पुस्तकालय संश्लेषित किया है और सीटू11में बैक्टीरियल निमोनिया का पता लगाने के लिए जांच समारोह के मूल्यांकन के लिए एक तेजी से, प्रभावी पाइपलाइन विकसित की है ।
उपयुक्त जांच उंमीदवारों की पहचान करने के लिए, निंनलिखित किसी और चीज के लिए FCFM द्वारा पूर्व vivo मानव फेफड़े के ऊतकों पर जांच की पूछताछ से पहले पूरा किया जाना था: i) जलीय घुलनशीलता, द्वितीय) विशिष्टता और selectivity तेजी से नैदानिक लेबलिंग के लिए प्रासंगिक बैक्टीरिया, iii) एक उच्च संकेत करने वाली शोर अनुपात, और iv) फेफड़ों के वातावरण के भीतर क्षरण के लिए प्रतिरोध । उत्तरार्द्ध तीव्र श्वसन संकट सिंड्रोम (ARDS), जो एक शर्त है कि आईसीयू में फेफड़ों में proteolytic और भड़काऊ वातावरण की विशेषता है के साथ रोगियों से bronchoalveolar लेवेज द्रव (BALF) द्वारा मूल्यांकन किया गया था । इसके अलावा, जांच मानव फेफड़े वायुकोशीय ऊतक के भीतर एक नैदानिक अनुमोदित ऑप्टिकल CLE इमेजिंग डिवाइस द्वारा पता लगाने के लिए एक उपयुक्त fluorophore था ।
इन आवश्यकताओं के प्रत्येक के लिए पूछताछ करने के लिए पाइपलाइन के रूप में इस प्रकार था (प्रत्येक चरण में, केवल जांच कि पारित अगले करने के लिए आगे ले जाया गया): (1) जांच की जानी करने के लिए एक पुस्तकालय संश्लेषित किया गया था; (2) प्रत्येक जांच के लिए फोकल लेजर स्कैनिंग माइक्रोस्कोपी (CLSM) के लिए जीवित बैक्टीरिया के एक पैनल के लिए जोड़ा गया था जीवाणु लेबलिंग सुनिश्चित करने के लिए; (३) प्राथमिक मानव न्यूट्रोफिल के साथ सह-संस्कृतियों में स्तनधारी कोशिकाओं पर जीवाणु लेबलिंग का selectivity CLSM द्वारा स्थापित किया गया; (४) ARDS रोगी BALF की उपस्थिति में जीवाणुओं की स्थिरता और सफल लेबलिंग CLSM और मैट्रिक्स असिस्टेड लेसर Desorption/Ionization-उड़ान के समय (मालदी-तोफ) मास स्पेक्ट्रोमेट्री द्वारा निर्धारित किया गया था; (5) उंमीदवारों की इष्टतम एकाग्रता CLSM द्वारा निर्धारित किया गया था, स्तनधारी कोशिकाओं पर बैक्टीरिया के लिए selectivity सुनिश्चित बनाए रखा गया था; (6) उंमीदवारों को निलंबन में FCFM द्वारा और पूर्व vivo मानव फेफड़े वायुकोशीय ऊतक पर स्थिरता सुनिश्चित करने के लिए और है कि संकेत करने वाली शोर का पता लगाने के लिए पर्याप्त था छवि थे । चरण 6 इस प्रोटोकॉल के भीतर विवरण में वर्णन किया गया है । 1-5 चरणों के लिए क्रियाविधि पहले रिपोर्ट किया गयाहै11 ।
रोग के दूसरे सबसे अधिक बोझ के लिए कम श्वसन पथ संक्रमण विश्व स्तर पर12,13, और रोगाणुरोधी प्रतिरोधी बैक्टीरिया के लिए जिंमेदार ठहराया संक्रमण की संख्या में एक पर्याप्त वृद्धि14बताया गया है । निमोनिया अस्पताल में भर्ती होने के लिए एक आम कारण रहता है । आईसीयू में, एक निमोनिया के विकास के नैदानिक अनिश्चितता से जटिल है और एक अत्यंत उच्च मृत्यु दर15के साथ जुड़ा हुआ है । निमोनिया की शुरुआत के दौरान, बैक्टीरिया बाहर फेफड़े के वायुकोशीय अंतरिक्ष के भीतर पैदा, एक क्षेत्र है कि अपेक्षाकृत बाँझ है, स्वास्थ्य में न्यूनतम microbiota के साथ.
इस विधि का वर्णन करता है अपेक्षाकृत देर मंच पूर्व vivo सत्यापन बैक्टीरिया विशेष ऑप्टिकल इमेजिंग जांच के11, लेकिन डिजाइन, संश्लेषण, और जांच मूल्यांकन शुरू करने से पहले इस मांयता कदम आवश्यक है, के रूप में पहले दिखाया गया है11 .
CLE वास्तविक समय में सीटू में रोग राज्यों से पूछताछ के लिए एक उभरती हुई नैदानिक तकनीक है. यह संदिग्ध फुफ्फुसीय विकृति है, जो एक बायोप्सी और लेवेज द्रव का संग्रह शामिल हो सकता है की जांच के लिए पारंपरिक तकनीक पर कई लाभ प्रदान करता है । बायोप्सी इनवेसिव और हवादार रोगियों में रुग्णता और मृत्यु का कारण बन सकता है, और एकत्र लेवेज द्रव अक्सर ऊपरी एयरवेज से बैक्टीरिया के साथ दूषित है । निमोनिया का पता लगाने में CLE का उपयोग लेकिन कुछ हद तक संगत इमेजिंग जांच जो रोग के कार्यात्मक जानकारी प्रदान कर सकते हैं की खराब उपलब्धता की वजह से सीमित है, कई ठोस प्रयासों के बावजूद10. ऑप्टिकल एजेंटों के साथ CLE का मेल निमोनिया का निदान तेजी से और कम इनवेसिव वर्तमान मानक अभ्यास की तुलना में की संभावना प्रदान करता है ।
इस प्रोटोकॉल के लिए महत्वपूर्ण कदम नमूना तैयारी और CLE मंच के सेटअप में हैं । मानव ऊतक अंतिम नैदानिक आवेदन करने के लिए प्रासंगिक प्राप्त करने के रूप में इस अध्ययन के भीतर प्रदर्शित मानव फेफड़े के ऊतकों के रूप में भी महत्वपूर्ण है । यह मानव ऊतक का उपयोग करने के लिए आवश्यक है क्योंकि ऊतक autofluorescence की हद तक बड़ी अंतर प्रजातियों भिन्नता से पता चलता है, और इसलिए बैक्टीरिया की संवेदनशीलता को गुमराह कर सकते हैं-जांच imaged जा रहा है. इसके अतिरिक्त, मानव फेफड़ों के ऊतकों की पुनर्प्राप्ति और उपयोग के लिए नैतिकता प्राप्त करना आवश्यक है । एक तकनीकी स्तर से, इमेजिंग LSU मंच के लिए सही सफाई, इमेजिंग फाइबर का लगाव, और अंशांकन अच्छा संकल्प और सुसंगत इमेजिंग के लिए आवश्यक है, के रूप में बैक्टीरिया के बराबर संख्या सुनिश्चित कर रहा है प्रत्येक फेफड़ों के ऊतकों के नमूने के लिए जोड़ रहे हैं । आगे की जांच पैनलों के लिए इस विधि की उपयोगिता का विस्तार करने के लिए, रोगजनकों की एक सीमा के साथ प्रक्रिया दोहरा, जैसे कि निमोनिया के रोगज़नक़ एजेंट होने की संभावना के रूप में आवश्यक है ।
इस तकनीक की सबसे बड़ी सीमा है कि नैदानिक अनुमोदित CLE डिवाइस केवल एक लेज़र (४८८ एनएम) है । इसलिए, वर्तमान में, जांच डिजाइन के लिए fluorophore का चयन इस प्रणाली के साथ प्रयोग के लिए सीमित है, हालांकि चिकित्सकीय अनुमोदित एकल रंग उपकरणों ६६० एनएम और निकट अवरक्त के उत्तेजना तरंग दैर्ध्य के साथ मौजूद हैं । यह अत्यधिक वांछनीय है एक दूसरी लेजर एक ही डिवाइस के भीतर लागू करने के लिए एक जांच सक्षम करने के लिए एक वर्णक्रमीय अलग fluorophore के साथ विकसित करने के लिए बैक्टीरिया में सुधार-जांच संवेदनशीलता ऊतक autofluorescence के स्तर पर । Whilst दोहरे रंग CLE उपकरणों के विकास के अधीन हैं, वे या तो नैदानिक अनुमोदित नहीं कर रहे है और/या उनकी लागत16महत्वपूर्ण है ।
विट्रो में CLE रोगजनक बैक्टीरिया और पूर्व vivo मानव फेफड़ों के ऊतकों का उपयोग करने के लिए संभावित जांच स्क्रीन करने के लिए इन विट्रो तकनीकों में प्रवाह cytometry और CLSM, और नैदानिक उपयोगिता के रूप में पारंपरिक के बीच अंतर पुलों । इस कदम को आगे ले नैदानिक CLE इमेजिंग के साथ युग्मित करने के लिए होनहार यौगिकों का चयन करते समय आत्मविश्वास प्रदान करता है; और क्या परीक्षण जांच लक्ष्य विशिष्टता का कहना है, या के रूप में संकेत प्रदान करेगा किसी भी बंद लक्ष्य लेबलिंग, ऊतक, या मेजबान proteolytic एंजाइमों के साथ अस्थिरता से पता चलता है के रूप में सीधे बाध्यकारी । यह भी activatable जांच के प्रत्येक सीधे मानव फेफड़े के ऊतकों से अधिक बैक्टीरिया के नमूनों को जोड़ने के लिए उचित होगा, पूरी तरह से जांच बाध्यकारी और वास्तविक समय में सक्रियण की गति को चिह्नित ।
हम मानते है कि तेजी से उपंयास बैक्टीरिया-विशिष्ट जांच के लिए हमारी पाइपलाइन रोगियों के बाहर फेफड़ों के भीतर इमेजिंग के लिए उनकी क्षमता का आकलन करने के लिए क्लिनिक के लिए बहुत तेजी से अनुवाद में परिणाम होगा । यह काफी हद तक है क्योंकि बैक्टीरिया विशेष जांच एक bronchoscope के काम चैनल नीचे डाला कैथेटर के माध्यम से फेफड़ों के भीतर स्थानीय रूप से वितरित किया जा सकता है, जिसका अर्थ है कि microdose (< 100 µ g) मात्रा दिया जा सकता है । इसलिए, प्रणालीगत वितरण और यौगिक का वितरण एक चिंता का विषय नहीं है, के रूप में शरीर के भीतर कई अंय संक्रमण के लक्ष्य के लिए मामला है, या परमाणु इमेजिंग के साथ । इसके अलावा, इस तरह के एक छोटे से खुराक में इमेजिंग जांच देने विषाक्तता संबंधित जटिलताओं के जोखिम को कम कर देता है (हालांकि विषाक्तता स्क्रीनिंग अनुवाद के लिए आवश्यक होगा) । जांच के जगाकर के बाद, कैथेटर तो FCFM फाइबर और CLE द्वारा पूछताछ की फेफड़े के एक ही क्षेत्र से प्रतिस्थापित किया जा सकता है, बहुत उसी तरह हम इस विधि के भीतर प्रदर्शन किया है । इमेजिंग जांच से पहले जांच की स्थापना के बाद तेजी से किया जाना चाहिए undetectable सांद्रता के लिए दूर बहाकर ।
यह भी ध्यान रखना महत्वपूर्ण है कि रोग की जांच-पड़ताल इस तकनीक द्वारा जांच जीवाणु इमेजिंग एजेंटों तक ही सीमित नहीं है, लेकिन यह भी सूजन के रूप में वैकल्पिक लक्ष्य, के साथ जांच के सत्यापन के लिए विस्तार कर सकता है । यह दृष्टिकोण भी शरीर के भीतर अंय रोग स्थानों के लिए अनुकूलनीय होना चाहिए जहां FCFM के माध्यम से इमेजिंग की अनुमति है ।
The authors have nothing to disclose.
हम इंजीनियरिंग और भौतिक विज्ञान अनुसंधान परिषद (EPSRC, यूनाइटेड किंगडम) को धन्यवाद देना चाहूंगा कि स्वास्थ्य नवाचार चैलेंज फंड (HICF) के माध्यम से स्वास्थ्य विभाग और वेलकम ट्रस्ट के साथ K03197X/ . फंडिंग संदर्भ संख्या: 0510-069 ।
1-14 Microfuge | SciQuip | 90616 | Small benchtop microcentrifuge |
96-well plate | Corning | 3370 | Assay plate |
Calcein AM | Sigma Aldrich | 17783 | Commercial fluorescent dye |
Cellvizio 488 nm Research CLE | Mauna Kea Technologies | LC-0001-488 | Confocal laser endomicroscopy device |
Cletop-S | Cletop | 14110601 | Fibre cleaner |
Eppendorf (1.5 mL) | Eppendorf | 30120086 | 1.5 mL microfuge tube |
Eppendorf Research Plus Pipettes | Fisher Scientific | 11568663 | Micro pipettes |
Falcon tube (50 mL) | Scientific Lab Supplies | 352070 | 50 ml centrifugation tube |
Gibco Phosphate Buffered Saline | Thermo Fisher Scientific | 10010023 | PBS – wash media |
IC-Viewer | Mauna Kea Technologies | LW-0001 | Data collection and processing software for the research CellVizio 488 nm system |
Incu-Shake midi | Sciquip | SQ-4020 | Floor standing shaking incubator |
Lysogeny Broth | Sigma Aldrich (Miller) | L3522 | LB Growth media for S. aureus |
non-standard research AlveoFlex 488 nm | Mauna Kea Technologies | MP-0002-AF3 | Fibred confocal fluorescence microscopy fibre |
Quanti Kit 488 nm | Mauna Kea Technologies | LQ-0005 | Calibration kit for the CellVizio 488 system |
S. aureus ATCC 25923 | ATCC | 25923 | Bacterial strain used in this study |
Semi-micro spectrophotometry cuvette | Sigma Aldrich | C5416-100EA | For spectrophotometry |
Thermomixer comfort | Eppendorf | 41102422 | Benchtop heater with shaking |
UV 1101 Biotech photometer | Biochrom WPA | Spectrophotometer |