Denne teknikken beskriver en effektiv screening-prosess for evaluering bakterier-spesifikke optisk tenkelig agenter innen ex vivo menneskelige lungevev, av blanke fluorescens AC confocal mikroskopi for rask identifisering av små molekyl kjemiske sonden-kandidater med oversettbare potensial.
Forbedre hastigheten og nøyaktigheten av bakteriell oppdagelsen er viktig for pasienten lagdeling og sikre riktig bruk av poesi aksent. Å oppnå dette målet, utviklingen av diagnostiske teknikker for å gjenkjenne bakteriell tilstedeværelse i sanntid på point-of-care er nødvendig. Optisk tenkelig for direkte identifikasjon av bakterier i verten er en attraktiv tilnærming. Flere forsøk på kjemiske sonde design og validering har blitt undersøkt, men ingen har ennå ble oversatt til klinikken. Her beskriver vi en metode for ex vivo validering av bakterier-spesifikke sonder for identifikasjon av bakterier i distale lungene, fotografert av blanke fluorescens AC confocal mikroskopi (FCFM). Vår modell brukes ex vivo menneskelige lungevev og en klinisk godkjent AC confocal laser endomicroscopy (CLE) plattform skjermen romanen bakterier-spesifikke imaging forbindelser, tett etterligne imaging forhold forventes å oppstå med pasienter. Derfor gir screening forbindelser av denne teknikken tillit for potensielle klinisk tractability.
Denne teknikken beskriver en rask screening-prosess for evaluering av bakterier-spesifikke optisk tenkelig agenter innen ex vivo menneskelige lungevev av CLE bruker FCFM for rask identifisering av forbindelser med potensielle klinisk verktøy for å visualisere bakterier i distale lunge i situ.
Det er et presserende globale krav til rasjon antimikrobielle forskrivning i tid med stigende resistensutvikling1. Dette søkte utviklingen av diagnostiske metoder som loven å identifisere bakteriell infeksjon med høy spesifisitet, følsomhet og i sanntid er svært2. Gjeldende teknikker å bekrefte diagnosen lungebetennelse i kritisk uvel pasienter, som de i intensivavdelinger (ICUs), er ofte avhengige av tolke uspesifisert klinisk eller radiologiske funksjoner sammen med bakteriell kultur teknikker fra aspirerede væsker/vev, som kan ta opp til 3 dager å produsere resultater. Videre bakteriell kultur fra væske innpodet i distale lungene og er utsatt for forurensning fra mer proksimale airways3 og er ofte kultur negative grunnet samtidig antimikrobielle terapi eller dårlig prøvetaking teknikker. I tillegg, er molekylær teknikker som polymerasekjedereaksjons følsom når den brukes på aspirerede væsker, risikerer overtreatment pasienter. Nye diagnostiske tilnærming er molekylære optisk tenkelig, gjør i situ molekylær patologi av vev en mulighet; utvikling og validering av optisk tenkelig forbindelser er imidlertid nødvendig. Likevel direkte visualisering av bakterier, via activatable optisk sonder er potensielt en veldig kraftig metode å tillate studiet av tilstedeværelse og utviklingen av lungebetennelse i pasienten, og viktigst, kan brukes til å studere vert-patogen interaksjoner i Svar til behandling i sanntid i situ.
PLIKT er en etablert undersøkende prosedyre i flere sykdommer4, inkludert innen feltene gastroenterologi5, onkologi6,7, og for å avhøre airways og alveolar sacs8, 9. kan point-of-care strukturelle bildebehandling av syke vev bruker en fiber imaging bundle, som passerer gjennom kanalen arbeider av en klinisk endoskop og skjemaer direkte kontakt med vevet overflaten til å avbildes av AC confocal mikroskopi. Imidlertid er en begrensning som gjenstår behovet for generell kontrast agenter. Bruk av sykdommen bestemte prober, som bestemt bakteriell agenter, kan derfor vesentlig utvide nytten av denne modaliteten ved å visualisere direkte bakterier på stedet av antatt infeksjon. Optisk agenter har mange fordeler over andre teknikker av aktivering av real-time, høy oppløsning bildebehandling med diagnostiske muligheter. Videre tilbyr optisk sonder utsiktene til multipleksing for avhør flere mål, alle oppnådd til en relativt lav kostnad. En rekke optiske agenter er under utvikling for slike formål, men ingen har ennå blitt implementert i klinikken10. Vi har syntetisert et bibliotek av små molekyl kjemiske sonder med spesifisitet mot bakterier og utviklet en rask, effektiv rørledning for evaluering av sonden-funksjonen for å oppdage bakteriell lungebetennelse i situ11.
For å finne passende sonde kandidater, hadde følgende forutsetninger oppfylles før avhør av sonden på ex vivo menneskelige lungevev av FCFM: i) vandig løselighet, ii) spesifisitet og selektivitet for raskt merking klinisk relevante bakterier, iii) en høy signal-til-støy-forhold og iv) motstand mot fornedrelse i lunge miljøet. Sistnevnte ble vurdert av bronchoalveolar lavage væske (BALF) fra pasienter med akutt respiratory distress syndrom (ARDS), som er en tilstand som er preget av proteolytisk og provoserende miljøer i lungene i ICU. Videre måtte sonder ha en passende fluorophore for deteksjon av en klinisk godkjent optisk CLE bildeenheten i menneskelig alveolar lungevev.
Rørledningen avhøre hver av disse forutsetningene var som følger (på hvert trinn, bare sonder som passerte ble båret frem til neste): (1) et bibliotek av sonder undersøkes ble syntetisert; (2) hver probe ble lagt til et panel av levende bakterier for AC confocal laserskanning mikroskopi (CLSM) for å sikre bakteriell merking; (3) selektivitet av bakteriell merking over pattedyrceller i co kulturer med primære menneskelige nøytrofile ble etablert av CLSM; (4) stabilitet og vellykket merking av bakterier i nærvær av ARDS pasienten BALF ble bestemt av CLSM og Matrix assistert Laser desorpsjon/ionisering-tid på fly (MALDI-TOF) massespektrometri; (5) optimal konsentrasjon av kandidater ble bestemt av CLSM, sikre selektivitet for bakterier over pattedyrceller ble opprettholdt; (6) kandidater ble fotografert av FCFM i suspensjon på ex vivo menneskelige alveolar lungevev å sikre stabilitet og som signal-til-støy var tilstrekkelig for gjenkjenning. Trinn 6 er beskrevet i detalj i denne protokollen. Metodikk for trinn 1-5 er tidligere rapportert11.
Nedre luftveisinfeksjoner utgjør nest høyeste byrden av sykdom globalt12,13, og en betydelig økning i antall infeksjoner tilskrevet antimikrobielle-resistente bakterier har vært rapportert14. Lungebetennelse er en vanlig årsak til sykehusinnleggelse. I ICU, utviklingen av en lungebetennelse er forsterket av diagnostiske usikkerhet og er forbundet med en svært høy dødelighet frekvensen15. Under utbruddet av lungebetennelse spre bakterier innen alveolar distale lungene, et område som er relativt sterilt, med minimal bakterieflora i helse.
Denne metoden beskriver relativt sent stadium ex vivo validering av bakterier-spesifikke optisk tenkelig sonder11, men design, syntese, og sonde evaluering før begynnelsen dette valideringstrinnet er viktig, som tidligere vist11 .
PLIKT er en nye kliniske teknikk for avhør sykdom stater i situ i sanntid. Det gir mange fordeler over tradisjonelle teknikker for å undersøke mistenkt lunge patologi, noe som kan innebære en biopsi og samling av lavage væsken. Biopsier er invasiv og kan forårsake sykelighet og dødelighet i ventilert pasienter, og samlet lavage væske er ofte forurenset med bakterier fra øvre luftveiene. Bruk av CLE i deteksjon av lungebetennelse er men litt begrenset på grunn av dårlig tilgjengeligheten av kompatibel imaging sonder som kan gi funksjonelle informasjon av sykdom, til tross for mange felles innsats10. Kombinere CLE med optisk agenter tilbyr utsiktene for diagnostisering lungebetennelse raskere og mindre forhold invasively til dagens standard praksis.
Punktene kritisk til denne protokollen er i prøven forberedelse og installasjon av CLE-plattformen. Innhenting av menneskelig vev gjelder for den endelige klinisk anvendelsen er også viktig, for eksempel menneskelige lungevev som vist i denne studien. Det er nødvendig å bruke menneskelig vev fordi omfanget av vev autofluorescence viser store Inter-arter variasjoner, og kan derfor villede sensitiviteten av bakterier-sonden blir fotografert. I tillegg er det viktig å skaffe etikk for innhenting og bruk av menneskelige lungevev. Fra et teknisk nivå, riktig rengjøring er vedlegg av tenkelig fiber tenkelig LSU plattform og kalibrering avgjørende for god oppløsning og konsistent avbildning, som er å sikre tilsvarende antall bakterier legges til hver lunge Vevsprøve. For å ytterligere utvide nytten av denne metoden for screening panelene av sonder, er gjenta prosedyren med en rekke patogener, som de sannsynligvis forårsaker agenter av lungebetennelse nødvendig.
Den største begrensningen for denne teknikken er at klinisk godkjent CLE enheten har bare én laser (488 nm). Derfor er valg av fluorophore for sonden design foreløpig begrenset til bruk med dette systemet, men klinisk godkjent én farge enheter eksisterer med eksitasjon bølgelengder av 660 nm og nær infrarød. Det er svært ønskelig å ha en ny laser linje gjennomført innenfor den samme enheten til å aktivere en sonde utvikles med en spectrally distinkte fluorophore å forbedre bakterier-sonden følsomhet over nivået på vev autofluorescence. Mens dual-farge CLE enheter er under utvikling, de er heller ikke klinisk godkjent og/eller kostnadene er betydelig16.
PLIKT i vitro med patogene bakterier og ex vivo menneskelige lungevev til skjermen potensielle sonder broer mellom konvensjonelle i vitro teknikker som flowcytometri og CLSM og klinisk nytte. Dette trinnet tilbyr tillit når du velger lovende forbindelser å videreføre å være kombinert med klinisk CLE imaging; og gir indikasjon om testet sonden opprettholder målet spesifisitet, eller viser alle off-målet merking, for eksempel binding direkte til vev, eller viser ustabilitet med vert proteolytiske enzymer. Det ville også være relevant å legge hver av activatable sonder direkte til eksempler på menneskelig lungevev og bakterier, for fullt karakterisere sonde bindende og aktivisering i sanntid.
Vi tror at vår rørledning for raskt screening romanen bakterier-spesifikke sonder for å vurdere deres potensial for bildebehandling i distale lungene pasienter vil føre mye raskere oversettelse til klinikken. Dette er hovedsakelig fordi bakterier-spesifikke proben kan leveres lokalt i lungene gjennom et kateter settes inn ned arbeider kanalen av en bronchoscope, betyr at microdose (< 100 µg) beløp kan leveres. Derfor er systemisk levering og biodistribution av sammensatt ikke et problem, som er tilfelle for mange andre infeksjon mål i kroppen, eller med kjernefysiske bildebehandling. Videre leverer tenkelig sonden i slike en liten dose reduserer risiko for forgiftning tilknyttede komplikasjoner (selv om toksisitet screening ville være nødvendig for oversettelse). Etter instillasjon av sonden, kateter kan deretter bli erstattet av FCFM fiber og den samme regionen i lungene avhørt av CLE, mye på samme måte som vi har utført i denne metoden. Imaging skal utføres raskt etter installasjonen av sonden før sonden vasker bort til undetectable konsentrasjoner.
Det er også viktig å merke seg at screening av sykdom-identifiserende sonder av denne teknikken bør ikke begrenses til bakteriell-imaging agenter, men kan også utvide til validering av sonder med alternative mål som betennelse. Denne tilnærmingen skal tilpasses andre sykdom steder i kroppen hvor tenkelig via FCFM er tillatt.
The authors have nothing to disclose.
Vi vil gjerne takke Engineering og Physical Sciences Research Council (EPSRC, Storbritannia) tverrfaglig forskningssamarbeid gi EP/K03197X/1, Department of Health og Wellcome Trust gjennom helse innovasjon utfordring Fund (HICF) . Finansiering referansenummer: 0510-069.
1-14 Microfuge | SciQuip | 90616 | Small benchtop microcentrifuge |
96-well plate | Corning | 3370 | Assay plate |
Calcein AM | Sigma Aldrich | 17783 | Commercial fluorescent dye |
Cellvizio 488 nm Research CLE | Mauna Kea Technologies | LC-0001-488 | Confocal laser endomicroscopy device |
Cletop-S | Cletop | 14110601 | Fibre cleaner |
Eppendorf (1.5 mL) | Eppendorf | 30120086 | 1.5 mL microfuge tube |
Eppendorf Research Plus Pipettes | Fisher Scientific | 11568663 | Micro pipettes |
Falcon tube (50 mL) | Scientific Lab Supplies | 352070 | 50 ml centrifugation tube |
Gibco Phosphate Buffered Saline | Thermo Fisher Scientific | 10010023 | PBS – wash media |
IC-Viewer | Mauna Kea Technologies | LW-0001 | Data collection and processing software for the research CellVizio 488 nm system |
Incu-Shake midi | Sciquip | SQ-4020 | Floor standing shaking incubator |
Lysogeny Broth | Sigma Aldrich (Miller) | L3522 | LB Growth media for S. aureus |
non-standard research AlveoFlex 488 nm | Mauna Kea Technologies | MP-0002-AF3 | Fibred confocal fluorescence microscopy fibre |
Quanti Kit 488 nm | Mauna Kea Technologies | LQ-0005 | Calibration kit for the CellVizio 488 system |
S. aureus ATCC 25923 | ATCC | 25923 | Bacterial strain used in this study |
Semi-micro spectrophotometry cuvette | Sigma Aldrich | C5416-100EA | For spectrophotometry |
Thermomixer comfort | Eppendorf | 41102422 | Benchtop heater with shaking |
UV 1101 Biotech photometer | Biochrom WPA | Spectrophotometer |