מיקרוסקופ intravital של יונת מונוציט, הקשורות הגידול אנגיוגנזה במודל מאתר של מחלת עורקים היקפית
Summary
ומונוציטים הם מתווכים חשובים של arteriogenesis בהקשר של מחלת עורקים היקפית. פרוטוקול זה באמצעות מטריקס קרום המרתף דמוי מיקרוסקופ intravital, חוקר אנגיוגנזה ביות ו הקשורות הגידול מונוציט לאחר ההזרקה מונוציט במודל מאתר מצדו בעורק הירך.
Abstract
המטרה הטיפולית של מחלת עורקים היקפית, מחלת לב איסכמית היא להגביר את זרימת הדם לאזורים איסכמי הנגרמת על ידי היצרות בגרימת. כירורגיית כלי דם היא אפשרות מעשית במקרים נבחרים, אך עבור חולים ללא אינדיקציות לניתוח כמו התקדמות לנוח כאב, איסכמיה איבר חיוני או השיבושים הגדולים החיים או לעבוד, יש כמה אפשרויות להקלת המחלה שלהם. טיפול בתאי דרך משופרת מונוציט זלוף באמצעות הגירוי של משני צורה היא אחת מתוך כמה אפשרויות לא פולשנית.
הקבוצה שלנו בוחן את arteriogenesis לאחר ההשתלה מונוציט לתוך עכברים באמצעות מודל איסכמיה hindlimb. בעבר, הראו שיפור זלוף hindlimb באמצעות השתלת מגורה-טטנוס מונוציט syngeneic. בנוסף, את ההשפעות על היווצרות משני הגידול יכולה להיות מושפעת גם טיפול זה. כדי לחקור תופעות אלה, אנו משתמשים דגם העכבר כמו קרום המרתף מטריקס באמצעות הזרקה של מטריצה חוץ-תאית סרקומה Engelbreth-הולם-נחיל לתוך האגף של העכבר, לאחר חסימה של עורק הירך.
לאחר הלימודים גידול מלאכותיים, אנו משתמשים במיקרוסקופ intravital ללמוד ויוו -אנגיוגנזה ו מונוציט ביות בתוך העורקים משני. מחקרים קודמים תיארו בחינה היסטולוגית של מודלים בבעלי חיים, אשר מובנית כבר חשפה לחפצים פוסט-מורטם . הגישה שלנו מדמיין מונוציט יונת לאזורים של collateralization רצפים בזמן אמת, קל לביצוע, והוא חוקר את התהליך של אנגיוגנזה arteriogenesis ואת הגידול בתוך vivo.
Introduction
מחלות לב וכלי דם, כולל מחלת לב כלילית או מחלת עורקים היקפית, הם הסיבות הנפוצות ביותר של מוות ברחבי העולם1. טיפול בתאי היא גישה מבטיחה לטיפול במחלות לב וכלי דם, במיוחד עבור אנשים שאינם יכולים לעבור התערבויות כירורגיות. ישנן מספר גישות לשימוש תאים או חומרים מופרשים שלהם הכלי הטיפולי2,3, עם המטרה הכוללת לשפר את זלוף ולשמור על תפקוד לרקמות איסכמי, underperfused. ניסיון אחד כדי להשיג מטרה זו היא לשפר את arteriogenesis, אשר משפר את התפתחות משני העורקים. ומונוציטים הן סוג של תא חשובים הקשורים collateralization. הקבוצה שלנו התמקדה חוקרת את ההשפעות של monocytes באזורים של דלקת4,5, במיוחד באמצעות מודל איסכמיה hindlimb לזירוז איסכמיה ושלאחר דלקת6. ומונוציטים הביתה לאזורים של דלקת וגורמים תגובות מורכבות מערכתית להוביל להתפתחות של collateralization7.
עם השימוש של מיקרוסקופ intravital, אנחנו יכולים ללמוד את אופן הפעולה של אלה תאים ויוו ולבחון את יונת של monocytes שהוחדר לאזורים של דלקת. רוב המחקרים לשעבר לתאר רק אחרי המוות ניתוחים, המחזיקים חסרונות כולל הקדמה של חפצים היסטולוגית ומספרים גדולים של בעלי חיים נדרש על ההכנות. בגישה שלנו, אנחנו יכולים לחקור תהליכים אימונולוגי ולחיות משני צורה באמצעות הדמיה בנקודות זמן מרובים.
בנוסף התפתחות עורקים משני התחומים איסכמי, ומונוציטים גם להשפיע על הגידול. לחקור תהליכים אלו, אנו מזריקים מטריצה כמו קרום המרתף מופק סרקומה של העכבר Engelbreth-הולם-נחיל, גידול עשיר במטריצה חוץ-תאית חלבונים8, לנתח באמצעות מיקרוסקופ intravital. מטריצה זו משמשת ממבחן מולקולות או היווצרות רשת תא אנדותל או טיפולים אנטי סרטניים באמצעות עיכוב האנגיוגנזה; במקרה זה, ואנו נעריך את הפוטנציאל האנגיוגנזה הגידול של monocytes תא טיפול9,10,11.
המטרה של פרוטוקול זה היא להפגין דרך קלה ויעילה ללמוד תהליכים אימונולוגי הנגרמת על ידי איסכמיה במודל ויוו . אנחנו יכולים ליצור סביבת בדיקה מציאותית יותר בהשוואה workup היסטולוגית של רקמת השריר לאחר המוות .
Protocol
Representative Results
Discussion
השיטה המתוארת כאן שופך אור על התפתחות משני העורקים, את אופן הפעולה של monocytes בכלי האלה, ואת התהליך של arteriogenesis. השלבים על יישום פרוטוקול זה הם קל ללמוד והוא יכול לשמש גם בתחומים אחרים של המדע. למרות היתרונות הללו, ישנם כמה חסרונות. למשל, מיקרוסקופיים ציוד נדרש לבצע את הטכניקות המתואר. קבלת ציוד…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
עבודה זו נתמכה על ידי אחרת-Kröner-Stiftung ו SFB DFG (פתוח, קרן מחקר גרמני) 854 (Sonderforschungsbereich, מרכז מחקר שיתופי). תודה מיוחדת הנס-הולגר Gärtner, Audiovisuelles Medienzentrum, אוטו-פון-Guericke אוניברסיטת מגדבורג, מגדבורג, גרמניה, לקבלת תמיכה טכנית.
Materials
| 10% fetal calf serum (FCS) | Sigma Aldrich, Hamburg, Germany | ||
| 1% penicillin/streptomycin | Sigma Aldrich, Hamburg, Germany | ||
| 1mL Omnifix -F insuline syringe | B. Braun, Melsungen AG, Melsungen, Germany | ||
| 50 ml syringe | Fresenius Kabi AG, Bad Homburg, Germany | Injectomat- syringe 50 ml with canule | |
| 6-well-ultra-low-attachement-plates | Corning Incorporated, NY, USA | ||
| 8- 12 week old, male, C57BL/6, BalbC mice | Charles River, Sulzfeld, Germany | ||
| Adhesive tape | TESA SE, Hamburg, Germany | ||
| Acquisition Software | Leica, Wetzlar, Deutschland | Leica Application Suite Advanced Fluorescence (LAS AF); Version: 2.7.3.9723 | |
| Canules | B. Braun, Melsungen AG, Melsungen, Germany | 29G, 30G | |
| Cell culture dish | Greiner Bio-One GmbH, Frickenhausen, Germany | ||
| Cell culture medium | Manufactured by our group with single components | Medium199, 10% Fetal calf serum, 1% Antibiotic (penicillin/streptomycin) | |
| Centrifuge | Beckman Coulter GmbH, Krefeld, Germany | Allegra X-15R centrifuge | |
| Depilatory cream | Veet, Mannheim, Germany | ||
| DiO | Invitrogen Eugene, Oregon, USA | ||
| Disinfection agent | Schülke&Mayr GmbH, Norderstedt, Germany | ||
| Disposable scalpel No.10 | Feather safety razor Co.Ltd, Osaka, Japan | ||
| EDTA | Sigma Aldrich, Hamburg, Germany | ||
| Erlenmeyer flask | GVB, Herzogenrath, Germany | ||
| Ethanol 70% | Otto Fischar GmbH und Co KG, Saarbrücken, Germany | ||
| Fetal Calf Serum | Sigma Aldrich, Hamburg, Germany | ||
| Fine Forceps | Rubis, Stabio, Switzerland | ||
| Flurophor/Rhodamindextran | Thermo Fischer Scientific, Waltham, MA USA | Katalognummer: D-1819 | |
| Gloves | Rösner-Matby Meditrade GmbH, Kiefersfelden, Germany | ||
| Heating pad | Labotect GmbH, Göttingen, Germany | Hot Plate 062 | |
| Human macrophage-colony stimulating factor | Sigma Aldrich, Hamburg, Germany | SRP3110 | |
| Humane leucocyte filters | Blood preservation | ||
| Incubator | Ewald Innovationstechnik GmbH, Bad Nenndorf, Germany | ||
| Isoflurane | Baxter Deutschland GmbH, Unterschleißheim, Germany | ||
| Ketamine (10%) | Ketavet, Pfizer Deutschland GmbH, Berlin , Germany | ||
| Leukocyte separation tubes (tubes with filter) | Bio one GmbH, Frickenhausen, Germany | ||
| Light microscope | Carl Zeiss SMT GmbH, Oberkochen, Germany | Axiovert 40 C | |
| Lymphocyte separation medium LSM1077 | GE Healthcare, Pasching, Austria | ||
| Matrigel | Becton, Dickinson and Company, Franklyn Lakes, New Jersey, USA | ||
| Medium M199 | PAA Laboratories GmbH, Pasching, Austria | ||
| Microbiological work bench | Thermo Electron, LED GmbH, Langenselbold, Germany | Hera safe | |
| Microscope slide | Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe | Art. Nr. 1879 | |
| Microscope stand with incubator and heating unit | Leica DMI 6000, Pecon, Germany | ||
| Monocyte wash buffer | Manufactured by our group with single components | PBS, 0,5% BSA, 2mM EDTA | |
| Mouse restrainer | Various | ||
| Multi-photon microscope | Leica, Wetzlar, Deutschland | Leica SP5 Confocal microscope, Cameleon, Coherent | |
| NaCl (0,9%) | Berlin Chemie AG, Berlin, Germany | ||
| Neubauer counting chamber | Paul Marienfeld GmbH und Co.KG, Lauda-Königshofen, Germany | ||
| Objective | Leica, Wetzlar, Deutschland | Leica HC PL APO 10x/0.4 CS | |
| PBS | Life technologies GmbH, Darmstadt, Germany | ph 7,4 sterile | |
| Penicillin/Streptomycin | Sigma Aldrich, Hamburg, Germany | ||
| Percoll | Manufactured by our group with single components | 90 % Percoll, 10% 1,5M NaCl, ρ= 1,064 g cm-3 | |
| Percoll solution | GE Healthcare, Bio-Science AB, Uppsala, Sweden | ||
| Pipettes | Eppendorf AG, Hamburg, Germany | 10µL/100µL/200µL/1000µL | |
| Pipettes serological | Greiner Bio-One GmbH, Frickenhausen, Germany | Cellstar2ml, 5ml, 10ml | |
| Pipetting heads | Eppendorf AG, Hamburg, Germany | ||
| Pipetus | Eppendorf AG, Hamburg, Germany | ||
| Polystyrol tube | Cellstar, Greiner Bio-One GmbH, Frickenhausen, Germany | ||
| Scissor | Word Precision Instruments, Inc., Sarasota, USA | ||
| Scale | Mettler PM4800 Delta Range, Mettler-Toledo GmbH, Gießen, Germany | ||
| Suction unit | Integra bioscience, Fernwald, Germany | Vacusafe comfort | |
| Surgical scissors | Word Precision Instruments, Inc., Sarasota, USA | ||
| Trypan blue solution 0,4 % | Sigma Aldrich, Hamburg, Germany | ||
| Tubes with cap | Greiner Bio-One GmbH, Frickenhausen, Germany | 15ml, 50ml Cellstar | |
| Xylazine (2 %) | Ceva Tiergesundheit GmbH, Düsseldorf, Germany |
Referências
- Volz, K. S., Miljan, E., Khoo, A., Cooke, J. P. Development of pluripotent stem cells for vascular therapy. Vascular pharmacology. 56 (5-6), 288-296 (2012).
- Henry, T. D., et al. The VIVA trial: Vascular endothelial growth factor in Ischemia for Vascular Angiogenesis. Circulation. 107 (10), 1359-1365 (2003).
- Wagner, M., et al. Isolation and intravenous injection of murine bone marrow derived monocytes. Journal of visualized experiments JoVE. (94), (2014).
- Herold, J., et al. Transplantation of monocytes: a novel strategy for in vivo augmentation of collateral vessel growth. Human gene therapy. 15 (1), 1-12 (2004).
- Ito, W. D., Arras, M., Scholz, D., Winkler, B., Htun, P., Schaper, W. Angiogenesis but not collateral growth is associated with ischemia after femoral artery occlusion. The American journal of physiology. 273 (3 Pt 2), H1255-H1265 (1997).
- Herold, J., et al. Tetanus toxoid-pulsed monocyte vaccination for augmentation of collateral vessel growth. Journal of the American Heart Association. 3 (2), e000611 (2014).
- . Matrigel Matrix Available from: https://www.corning.com/au/en/products/life-sciences/products/surfaces/matrigel-matrix.html (2017)
- Eubank, T. D., Galloway, M., Montague, C. M., Waldman, W. J., Marsh, C. B. M-CSF induces vascular endothelial growth factor production and angiogenic activity from human monocytes. Journal of immunology (Baltimore, Md. 1950). 171 (5), 2637-2643 (2003).
- Fridman, R., et al. Enhanced tumor growth of both primary and established human and murine tumor cells in athymic mice after coinjection with Matrigel. Journal of the National Cancer Institute. 83 (11), 769-774 (1991).
- Woodman, S. E., et al. Caveolin-1 knockout mice show an impaired angiogenic response to exogenous stimuli. The American journal of pathology. 162 (6), 2059-2068 (2003).
- Francke, A., Weinert, S., Strasser, R. H., Braun-Dullaeus, R. C., Herold, J. Transplantation of bone marrow derived monocytes: a novel approach for augmentation of arteriogenesis in a murine model of femoral artery ligation. American journal of translational research. 5 (2), 155-169 (2013).
- Houthuys, E., Movahedi, K., Baetselier, P., de Van Ginderachter, J. o. A., Brouckaert, P. A method for the isolation and purification of mouse peripheral blood monocytes. J. Immunol. Methods. 359 (1-2), 1-10 (2010).
- Berthold, F. Isolation of human monocytes by Ficoll density gradient centrifugation. Blut. 43 (6), 367-371 (1981).
