إينترافيتال المجهري لصاروخ موجه الوحيدات والأوعية المتصلة بورم في نموذج مورين لأمراض الشرايين الطرفية
Summary
هي وحيدات الوسطاء هامة من أرتيريوجينيسيس في سياق أمراض الشرايين المحيطية. باستخدام مصفوفة مثل الغشاء والفحص المجهري إينترافيتال، يحقق هذا البروتوكول الوحيدات صاروخ موجه والمتصلة بورم الأوعية بعد حقن الوحيدات في نموذج موريني ربط شريان فخذي.
Abstract
والهدف العلاجي لأمراض الشرايين المحيطية، ومرض القلب الاقفاري زيادة تدفق الدم إلى المناطق الدماغية الناجمة عن تضيق الفسيولوجية. جراحة الأوعية الدموية خياراً قابلاً للتطبيق في حالات مختارة، ولكن للمرضى دون مؤشرات لعملية جراحية مثل التقدم بقية الألم، الاسكيمية الحرجة أطرافهم، أو اختلالات كبيرة في الحياة أو العمل، وهناك احتمالات قليلة للتخفيف من حدة المرض. خلية العلاج عن طريق نضح الوحيدات محسنة من خلال تحفيز تشكيل الجانبية واحدة من عدد قليل من الخيارات غير الغازية.
ويبحث مجموعتنا أرتيريوجينيسيس بعد زرع الوحيدات في الفئران باستخدام نموذج الاسكيمية اللكتات. سابقا، قد أثبتنا تحسن التروية اللكتات استخدام زرع الوحيدات سينجينيك حفز الكزاز. بالإضافة إلى آثار على تشكيل الجانبية، نمو الورم يمكن أن تتأثر بهذا العلاج، وكذلك. للتحقق من هذه التأثيرات، نستخدم نموذج مصفوفة الغشاء مثل ماوس عن طريق حقن المصفوفة خارج الخلية من ساركومه انجيلبريث-هولم-سرب في الجناح الماوس، بعد انسداد الشريان فخذي.
بعد الدراسات الورم الاصطناعي، نستخدم الفحص المجهري إينترافيتال للدراسة في فيفو ورم الأوعية والوحيدات صاروخ موجه داخل الشرايين الجانبية. وقد وصف الدراسات السابقة النسيجي النظر في نماذج حيوانية، الذي يفترض التحليل اللاحق للتحف بعد الوفاة . نهجنا يتصور الوحيدات صاروخ موجه إلى مجالات الضمانات الاحتياطية في تسلسل الوقت الحقيقي، من السهل القيام به، ويحقق عملية تولد الأوعية أرتيريوجينيسيس وورم في الجسم الحي.
Introduction
أمراض القلب والأوعية الدموية، بما في ذلك أمراض القلب والشرايين أو أمراض الشرايين الطرفية، هي الأسباب الأكثر شيوعاً للوفاة على الصعيد العالمي1. خلية العلاج هو اتباع نهج واعدة لعلاج أمراض القلب والأوعية الدموية، خاصة بالنسبة للأشخاص غير القادرين على الخضوع لعمليات جراحية. وهناك عدة نهج لاستخدام خلايا أو على مواد يفرزها كأداة علاجية2،3، مع الهدف العام لتحسين التروية والحفاظ على وظيفة الأنسجة الدماغية وأونديربيرفوسيد. محاولة واحدة لتحقيق هذا الهدف هو تحسين أرتيريوجينيسيس، مما يعزز تنمية الشرايين الجانبية. وحيدات نوع خلية هامة المرتبطة بالضمانات الاحتياطية. مجموعتنا ركزت على البحث في آثار وحيدات في مناطق من الالتهاب4،5، لا سيما باستخدام نموذج الاسكيمية اللكتات لحمل الاسكيمية، والتهاب اللاحقة6. الصفحة الرئيسية لمجالات التهاب وحيدات وتتسبب في الاستجابات النظامية المعقدة التي تؤدي إلى تطوير الضمانات الاحتياطية7.
مع استخدام الفحص المجهري إينترافيتال، يمكننا دراسة سلوك هذه الخلايا في الجسم الحي والاحتفال باستضافة أكثر من حقن وحيدات لمناطق التهاب. وتصف معظم الدراسات السابقة إلا بعد الوفاة من التحليلات، التي تنطوي على أضرار بما في ذلك مقدمة من التحف غذائها وإعداد كبيرة من الحيوانات اللازمة للأعمال التحضيرية. مع النهج الذي نتبعه، نحن يمكن التحقيق في العمليات المناعية ويعيش تشكيل الجانبية عن طريق التصوير في نقاط زمنية متعددة.
بالإضافة إلى وضع الشرايين الجانبية في المناطق الدماغية، وحيدات تؤثر أيضا على نمو الورم. للتحقيق في هذه العمليات، ونحن إدخال مصفوفة مثل الغشاء يستخرج من انجيلبريث-هولم-سرب ساركومه الماوس، ورم غنية في المصفوفة خارج الخلية البروتينات8، وتحليل استخدام الفحص المجهري إينترافيتال. يستخدم هذه المصفوفة لجزيئات اختبار الشاشة لتشكيل شبكة خلية بطانية أو العلاجات المضادة للسرطان عن طريق تثبيط الأوعية؛ وفي هذه الحالة، سوف نقيم إمكانيات الأوعية الورم وحيدات الخلية العلاج9،،من1011.
والهدف من هذا البروتوكول إظهار طريقة سهلة وفعالة دراسة العمليات المناعية الناجمة عن الاسكيمية في نموذج في فيفو . ونحن يمكن أن تولد بيئة اختبار أكثر واقعية مقارنة ب workup النسيجي للأنسجة العضلية بعد الوفاة .
Protocol
Representative Results
Discussion
الأسلوب الموصوفة هنا يلقي الضوء على وضع الشرايين الجانبية، سلوك وحيدات في هذه السفن، وعملية أرتيريوجينيسيس. الخطوات اللازمة لتطبيق هذا البروتوكول سهلة التعلم ويمكن استخدامها في مجالات أخرى من العلوم. وعلى الرغم من هذه المزايا، هناك بعض العيوب. على سبيل المثال، مطلوب معدات مجهرية لتنفيذ …
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
هذا العمل كان يدعمها ELSE-كرنر-ستيفتونغ و DFG (دويتشه الأوقيانوغرافية، مؤسسة البحوث الألمانية) SFB 854 (سونديرفورشونجسبيريتش، مركز البحوث التعاونية). خاص بفضل هانس-هولغر Gärtner، ميدينزينتروم أوديوفيسويليس، وجامعة أوتو-فون-غيريكا ماجدبورج، ماجدبورج، ألمانيا، لتقديم الدعم التقني.
Materials
| 10% fetal calf serum (FCS) | Sigma Aldrich, Hamburg, Germany | ||
| 1% penicillin/streptomycin | Sigma Aldrich, Hamburg, Germany | ||
| 1mL Omnifix -F insuline syringe | B. Braun, Melsungen AG, Melsungen, Germany | ||
| 50 ml syringe | Fresenius Kabi AG, Bad Homburg, Germany | Injectomat- syringe 50 ml with canule | |
| 6-well-ultra-low-attachement-plates | Corning Incorporated, NY, USA | ||
| 8- 12 week old, male, C57BL/6, BalbC mice | Charles River, Sulzfeld, Germany | ||
| Adhesive tape | TESA SE, Hamburg, Germany | ||
| Acquisition Software | Leica, Wetzlar, Deutschland | Leica Application Suite Advanced Fluorescence (LAS AF); Version: 2.7.3.9723 | |
| Canules | B. Braun, Melsungen AG, Melsungen, Germany | 29G, 30G | |
| Cell culture dish | Greiner Bio-One GmbH, Frickenhausen, Germany | ||
| Cell culture medium | Manufactured by our group with single components | Medium199, 10% Fetal calf serum, 1% Antibiotic (penicillin/streptomycin) | |
| Centrifuge | Beckman Coulter GmbH, Krefeld, Germany | Allegra X-15R centrifuge | |
| Depilatory cream | Veet, Mannheim, Germany | ||
| DiO | Invitrogen Eugene, Oregon, USA | ||
| Disinfection agent | Schülke&Mayr GmbH, Norderstedt, Germany | ||
| Disposable scalpel No.10 | Feather safety razor Co.Ltd, Osaka, Japan | ||
| EDTA | Sigma Aldrich, Hamburg, Germany | ||
| Erlenmeyer flask | GVB, Herzogenrath, Germany | ||
| Ethanol 70% | Otto Fischar GmbH und Co KG, Saarbrücken, Germany | ||
| Fetal Calf Serum | Sigma Aldrich, Hamburg, Germany | ||
| Fine Forceps | Rubis, Stabio, Switzerland | ||
| Flurophor/Rhodamindextran | Thermo Fischer Scientific, Waltham, MA USA | Katalognummer: D-1819 | |
| Gloves | Rösner-Matby Meditrade GmbH, Kiefersfelden, Germany | ||
| Heating pad | Labotect GmbH, Göttingen, Germany | Hot Plate 062 | |
| Human macrophage-colony stimulating factor | Sigma Aldrich, Hamburg, Germany | SRP3110 | |
| Humane leucocyte filters | Blood preservation | ||
| Incubator | Ewald Innovationstechnik GmbH, Bad Nenndorf, Germany | ||
| Isoflurane | Baxter Deutschland GmbH, Unterschleißheim, Germany | ||
| Ketamine (10%) | Ketavet, Pfizer Deutschland GmbH, Berlin , Germany | ||
| Leukocyte separation tubes (tubes with filter) | Bio one GmbH, Frickenhausen, Germany | ||
| Light microscope | Carl Zeiss SMT GmbH, Oberkochen, Germany | Axiovert 40 C | |
| Lymphocyte separation medium LSM1077 | GE Healthcare, Pasching, Austria | ||
| Matrigel | Becton, Dickinson and Company, Franklyn Lakes, New Jersey, USA | ||
| Medium M199 | PAA Laboratories GmbH, Pasching, Austria | ||
| Microbiological work bench | Thermo Electron, LED GmbH, Langenselbold, Germany | Hera safe | |
| Microscope slide | Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe | Art. Nr. 1879 | |
| Microscope stand with incubator and heating unit | Leica DMI 6000, Pecon, Germany | ||
| Monocyte wash buffer | Manufactured by our group with single components | PBS, 0,5% BSA, 2mM EDTA | |
| Mouse restrainer | Various | ||
| Multi-photon microscope | Leica, Wetzlar, Deutschland | Leica SP5 Confocal microscope, Cameleon, Coherent | |
| NaCl (0,9%) | Berlin Chemie AG, Berlin, Germany | ||
| Neubauer counting chamber | Paul Marienfeld GmbH und Co.KG, Lauda-Königshofen, Germany | ||
| Objective | Leica, Wetzlar, Deutschland | Leica HC PL APO 10x/0.4 CS | |
| PBS | Life technologies GmbH, Darmstadt, Germany | ph 7,4 sterile | |
| Penicillin/Streptomycin | Sigma Aldrich, Hamburg, Germany | ||
| Percoll | Manufactured by our group with single components | 90 % Percoll, 10% 1,5M NaCl, ρ= 1,064 g cm-3 | |
| Percoll solution | GE Healthcare, Bio-Science AB, Uppsala, Sweden | ||
| Pipettes | Eppendorf AG, Hamburg, Germany | 10µL/100µL/200µL/1000µL | |
| Pipettes serological | Greiner Bio-One GmbH, Frickenhausen, Germany | Cellstar2ml, 5ml, 10ml | |
| Pipetting heads | Eppendorf AG, Hamburg, Germany | ||
| Pipetus | Eppendorf AG, Hamburg, Germany | ||
| Polystyrol tube | Cellstar, Greiner Bio-One GmbH, Frickenhausen, Germany | ||
| Scissor | Word Precision Instruments, Inc., Sarasota, USA | ||
| Scale | Mettler PM4800 Delta Range, Mettler-Toledo GmbH, Gießen, Germany | ||
| Suction unit | Integra bioscience, Fernwald, Germany | Vacusafe comfort | |
| Surgical scissors | Word Precision Instruments, Inc., Sarasota, USA | ||
| Trypan blue solution 0,4 % | Sigma Aldrich, Hamburg, Germany | ||
| Tubes with cap | Greiner Bio-One GmbH, Frickenhausen, Germany | 15ml, 50ml Cellstar | |
| Xylazine (2 %) | Ceva Tiergesundheit GmbH, Düsseldorf, Germany |
Referências
- Volz, K. S., Miljan, E., Khoo, A., Cooke, J. P. Development of pluripotent stem cells for vascular therapy. Vascular pharmacology. 56 (5-6), 288-296 (2012).
- Henry, T. D., et al. The VIVA trial: Vascular endothelial growth factor in Ischemia for Vascular Angiogenesis. Circulation. 107 (10), 1359-1365 (2003).
- Wagner, M., et al. Isolation and intravenous injection of murine bone marrow derived monocytes. Journal of visualized experiments JoVE. (94), (2014).
- Herold, J., et al. Transplantation of monocytes: a novel strategy for in vivo augmentation of collateral vessel growth. Human gene therapy. 15 (1), 1-12 (2004).
- Ito, W. D., Arras, M., Scholz, D., Winkler, B., Htun, P., Schaper, W. Angiogenesis but not collateral growth is associated with ischemia after femoral artery occlusion. The American journal of physiology. 273 (3 Pt 2), H1255-H1265 (1997).
- Herold, J., et al. Tetanus toxoid-pulsed monocyte vaccination for augmentation of collateral vessel growth. Journal of the American Heart Association. 3 (2), e000611 (2014).
- . Matrigel Matrix Available from: https://www.corning.com/au/en/products/life-sciences/products/surfaces/matrigel-matrix.html (2017)
- Eubank, T. D., Galloway, M., Montague, C. M., Waldman, W. J., Marsh, C. B. M-CSF induces vascular endothelial growth factor production and angiogenic activity from human monocytes. Journal of immunology (Baltimore, Md. 1950). 171 (5), 2637-2643 (2003).
- Fridman, R., et al. Enhanced tumor growth of both primary and established human and murine tumor cells in athymic mice after coinjection with Matrigel. Journal of the National Cancer Institute. 83 (11), 769-774 (1991).
- Woodman, S. E., et al. Caveolin-1 knockout mice show an impaired angiogenic response to exogenous stimuli. The American journal of pathology. 162 (6), 2059-2068 (2003).
- Francke, A., Weinert, S., Strasser, R. H., Braun-Dullaeus, R. C., Herold, J. Transplantation of bone marrow derived monocytes: a novel approach for augmentation of arteriogenesis in a murine model of femoral artery ligation. American journal of translational research. 5 (2), 155-169 (2013).
- Houthuys, E., Movahedi, K., Baetselier, P., de Van Ginderachter, J. o. A., Brouckaert, P. A method for the isolation and purification of mouse peripheral blood monocytes. J. Immunol. Methods. 359 (1-2), 1-10 (2010).
- Berthold, F. Isolation of human monocytes by Ficoll density gradient centrifugation. Blut. 43 (6), 367-371 (1981).
