Hier presenteren we een kader hebben betrekking op breed scala dieet beperking genexpressie en levensduur. We beschrijven de protocollen voor breed scala dieet beperking en voor kwantitatieve beeldvorming van genexpressie onder dit paradigma. We schetsen verder computationele analyses te onthullen de functies van information processing van de genetische circuits onderliggende betrokken bij voedsel-sensing.
Zintuiglijke systemen kunnen dieren te detecteren, te verwerken en te reageren op hun omgeving. Overvloed van voedsel is een milieu cue die diepgaande gevolgen voor de dierlijke fysiologie en gedrag heeft. Onlangs, toonden we dat modulatie van de levensduur in de nematode Caenorhabditis elegans door overvloed van voedsel complexer is dan eerder herkend. Het reactievermogen van de levensduur tot veranderingen in voedsel niveau wordt bepaald door de specifieke genen die gedragen beheersen van informatieverwerking binnen een neurale circuit. Ons kader combineert genetische analyse, high-throughput kwantitatieve beeldvorming en informatietheorie. Hier beschrijven we hoe deze technieken kunnen worden gebruikt voor het karakteriseren van elk gen dat fysiologische relevant is voor breed scala dieet beperking. In het bijzonder deze workflow is ontworpen om te onthullen hoe een gen van belang regelt levensduur onder breed-scala dieet beperking; dan vast te stellen hoe de expressie van het gen varieert met voeding niveau; en tot slot, om te zorgen voor een onpartijdige kwantificering van de hoeveelheid informatie overgebracht door genexpressie over voedsel overvloed in de omgeving. Wanneer meerdere genen gelijktijdig in het kader van een neurale circuit onderzocht worden, kan deze werkstroom de codering strategie in dienst van het circuit ontdekken.
Alle organismen moeten kunnen te voelen en te reageren op veranderingen in de omgeving om te overleven. Bij dieren, het zenuwstelsel is de primaire detector en transducer van informatie over de omgeving en coördineert de fysiologische reactie op wijzigingen die van invloed kan zijn voor het organisme van survival1. Overvloed van voedsel is een milieu cue momenteel goed onderzocht in verschillende contexten die niet alleen voedselgerelateerde gedrag, zoals foerageren2 regelt, maar ook van invloed op de levensduur van een dier. De modulatie van levensduur door veranderingen in overvloed van voedsel is een fenomeen dat bekend staat als dieet beperking (DR), en heeft brede evolutionaire instandhouding3.
De nematode Caenorhabditis elegans is een krachtig modelsysteem voor het aanpakken van fundamentele biologische vragen. Een overvloed aan technieken zijn ontwikkeld waarmee voor het manipuleren van het genoom van de worm, zoals RNAi en in vivo gene bewerken technieken. De kleine fysieke grootte van de worm en de optische transparantie lenen zich ook voor in vivo imaging van zowel transcriptionele en translationele fluorescerende verslaggevers en het nut van high-throughput technologieën zoals microfluidics4. Deze hulpprogramma’s kunnen samen worden aangewend om te onderzoeken hoe neurale circuits directe dierlijk gedrag.
C. elegans is een Bacterivoor en verschillende methoden hebben gepubliceerd waarmee voor de nauwkeurige controle van de overvloed van voedsel door het manipuleren van bacteriële concentratie5,6,7,8 . Binnen de C. elegans onderzoeksgemeenschap, is DR onderzocht in twee verschillende contexten. De eerste kan worden betiteld als ‘klassieke DR’, zoals het weerspiegelt de veranderingen gezien in reactie op het verkleinen van voedsel niveaus in andere organismen. In dit verband, afnemende voedsel overvloed van ad libitum niveaus resulteert in een toenemende levensduur tot een optimale is bereikt, nadat dit punt levensduur met verdere vermindering van voedsel6,7afneemt, 9. Het tweede kader waaronder DR is onderzocht in C. elegans is dieet ontbering waarin de levensduur van de wormen wordt verhoogd met de volledige verwijdering van eventuele bacteriële voedsel bron10,11. In Entchev et al. (2015)12, we hebben laten zien dat de complexiteit van DR als gevolg van deze twee verschillende paradigma’s kan worden onderzocht gelijktijdig in een context die we noemen ‘breed-scala DR’. Met behulp van het protocol zoals hieronder beschreven, we geïdentificeerd een nieuwe klasse van genen die betrokken zijn bij DR dat bidirectionally het moduleren van de levensduur reactie op voedsel overvloed en zijn betrokken bij de neurale circuits die zin voedsel12 (Figuur 1).
De reactie van een dier op veranderingen in het milieu integreert een reeks biologische processen die de zintuigstelsel koppelen aan complexe regelgeving interacties overbrengen van milieu-informatie aan fysiologie. Hoewel de mechanistische details van dergelijke “informatiestroom” bekeken, vaak onbekend zijn, kunnen genetische’s worden gebruikt voor het verwerven van inzicht in hoe deze complexe berekening wordt georganiseerd onder verschillende biologische componenten. In ons recente werk toonden we dat daf-7 pt tph-1 zijn betrokken bij de overdracht van milieu-informatie over voedsel overvloed via een voedsel-sensing neurale circuit dat levensduur in C. elegans12 moduleert , 13. door het toepassen van het wiskundige kader van informatietheorie14, konden we kwantificeren van het bedrag van de milieu-informatie, in termen van bits, dat wordt vertegenwoordigd door het gen expressie veranderingen in daf-7 pt tph-1 in specifieke neuronen in verschillende niveaus. Daaruit konden we dan om te ontdekken de codering strategie in dienst van deze neurale en hoe het genetisch wordt gecontroleerd (Figuur 2).
In het volgende protocol schetsen we de stappen die nodig zijn om te begrijpen wat de gevolgen van de genen van belang uitgedrukt in specifieke neuronen zijn en hoe zij deelnemen aan de stroom van voedselinformatie uit omgeving naar levensduur. In het algemeen, onze kader is verdeeld in twee experimentele protocollen en een computationele workflow. Voor de experimentele aspecten, is het van cruciaal belang dat mutanten van de genen van belang dat onder brede-bereik kan worden onderzocht DR. Faithful transcriptionele verslaggevers zijn ook nodig om het kwantificeren van het niveau van de uitdrukking van de genen op verschillende niveaus. Om te kunnen overgaan tot de computationele analyse besproken in onze methode, moet de dataset van voldoende grootte tot zinvolle schattingen van expressie distributies op te leveren. Hoewel wij sjabloon broncodes voor de analyses bieden, moet de gebruiker vertrouwd zijn met de taal van de informatietheorie die uitgebreid door onze computationele kader wordt gebruikt. De broncodes zijn geschreven in R en C++. Daarom is een zekere mate van programmering vaardigheid ook verplicht toe te passen op een zinvolle manier.
Hier presenteren we een nieuwe methode voor dieet beperking die een veel breder scala van voedsel concentraties dan eerder gepubliceerde protocollen kapselt. Deze methode verbindt twee voorheen gescheiden verschijnselen gezien in C. elegans DR literatuur, bacteriële ontbering en klassieke dieet beperking, waardoor zowel dieet effecten worden bestudeerd onder één protocol. Met behulp van de nieuwe brede gasgroep DR paradigma, presenteren we een algemeen kader voor de behandeling van eencellige genexpressie in antwoord op een specifieke milieu cue en bepalen hoe deze cel informatie codeert. Ons kader bestaat uit twee experimentele protocollen die illustreren hoe u levensduur en kwantitatieve beeldvorming, respectievelijk uitvoert, onder brede-bereik DR. Data van deze experimentele protocollen kan vervolgens worden onderzocht met de computationele analyses waarin Dit kader te kwantificeren van de informatie die is gecodeerd door wijzigingen in het gen expressie niveaus of levensduur over verschillende voorwaarden.
Levensduur experimenten met behulp van breed-scala DR paradigma betrekken zes niveaus van de verschillende voedingsmiddelen (tabel 1). Dit vereist een meer arbeidsintensieve aanpak dan levensduur onder minder voedsel niveaus, zoals dieet ontbering10,11 te onderzoeken of het gebruik van de eten-2 genetische achtergrond35. Echter kunt onderzoeken op levensduur onder één voorwaarde beperken de interpretaties van de rol van een gen in DR. Bijvoorbeeld, bleek we onlangs dat daf-7 mutanten een bidirectionele demping van de reactie op voedsel concentratie ten opzichte van wild type dieren12 (figuur 1A). Bij gebrek aan voedsel weergeven daf-7 mutanten een verkorting van hun levensduur in vergelijking met wild type dieren. Als we alleen dieet ontbering overwogen hadden, wij zou hebben uitgelegd dat het gen van de daf-7 als noodzakelijk voor alleen levensduur verlenging, wanneer in feite de rol van de daf-7 complexer is. Daarom is de kritische uitkomst van dit deel van het protocol om te bepalen of een gen van belang is betrokken bij het moduleren van de algehele reactie van levensduur op veranderingen in overvloed van voedsel.
Een groot voordeel van dit protocol in vergelijking met andere methoden is dat het een nieuwe methode gebruikt voor het elimineren van de productie van nakomelingen in de dieren ondergaan levensduur analyse. De meeste studies gebruiken de drug FuDR voor de remming van de proliferatie van de germline bij volwassenen waardoor ze steriel. Recente studies hebben echter aangetoond FuDR behandeling voorwaarde – en gen-specifieke effecten op levensduur17,18,19,20,21, ter discussie kan hebben vraag de algemene toepasbaarheid ervan. In dit protocol, eliminatie van de productie van nakomelingen wordt bereikt door een 24-uurs behandeling van dieren met RNAi gericht op het gen van de ei-5 , dat de vorming van de chitine “eggshell” van remt bevrucht C. elegans eicellen resulterend in hun dood22,23. Het voordeel van deze methode is dat het zeer late-handelt en dus niet interfereert met de kiemcellen, dat een belangrijke regulator van de levensduur in C. elegans is.
Een mogelijke waarschuwing van het breed-scala DR protocol is de afhankelijkheid van het gebruik van de antibiotica om bacteriële proliferatie om te zorgen voor een strakke controle van bacteriële concentratie. Bacteriële proliferatie in de darm van de worm is bekend dat een belangrijke oorzaak van overlijden in C. elegans16. Dus, het gebruik van bacteriostatische antibiotica, zoals carbenicillin, in NGM agar voorkomt bacteriële proliferatie en verhoogt de levensduur van wormen in vergelijking met niet-antibioticum besturingselementen16. Bepaalde soorten antibiotica, zoals rifampicine36 en leden van de tetracycline familie37,38, is aangetoond dat het verlengen van de levensduur in C. elegans onafhankelijk van hun effect op de bacteriële proliferatie. Er is echter geen bewijs in de literatuur dat carbenicillin of streptomycine levensduur onafhankelijk van hun effect op de bacteriële proliferatie kan verhogen.
Levensduur kan worden gezien als de uitvoer van een complexe berekening waar milieu-informatie, gerouteerd door gen-expressie in neuronale netwerken, wordt doorgegeven aan de fysiologie. Ons protocol biedt een methode om te begrijpen hoe specifieke genen beïnvloeden deze stroom van milieu-informatie. Om aan deze vraag, moeten we betrouwbare beeldverwerking om te bepalen van de verdeling van gen expressie reacties op het niveau van één cel. Zijnde kundig voor schatten niet alleen de gemiddelde reactie van genexpressie aan veranderingen in overvloed van voedsel maar ook de volledige statistische verdeling van grote populaties vertegenwoordigt een belangrijke vereiste voor de toepasbaarheid van onze methode. Deze nauwkeurige beschrijving van gen expressie reacties op voedsel overvloed kan de toepassing van informatietheorie te kwantificeren van de informatie die is gecodeerd door de specifieke neuronen, alsmede de codering strategie in dienst van de neurale circuit.
De beeldvorming en Computationele aspecten van de methoden die worden beschreven in dit protocol gelden voor een groter aantal biologische contexten. In ons werk zijn we gericht op een kleine neurale netwerk deelnemen aan voedsel sensing, de analyses van informatieverwerking functies zijn echter niet beperkt tot een specifieke celtype of specifieke milieu signalen. Deze methodologieën kunnen in de toekomst mogelijk worden uitgebreid tot een grotere verscheidenheid van invoervariabelen, waardoor geen fysiologische uitvoer. Deze aanpak zal bijdragen tot een beter begrip van hoe regulerende netwerken van gen codeert, proces en doorgeven van gegevens.
The authors have nothing to disclose.
Wij danken de Bargmann en Horvitz labs voor reagentia. Sommige stammen werden verstrekt door de CGC, die wordt gefinancierd door de NIH kantoor van infrastructuur onderzoeksprogramma (P40 OD010440). Wij danken ook M. Lipovsek voor opmerkingen over het manuscript. Dit onderzoek werd gesteund door de Wellcome Trust (Project Grant 087146 aan Q.C.), BBSRC (BB/H020500/1 en BB/M00757X/1 tot Q.C.), European Research Council (NeuroAge 242666 naar Q.C.), ons National Institutes of Health (R01AG035317 en R01GM088333 naar H.L.), en de VS National Science Foundation (0954578 naar H.L., 0946809 GRFP tot M.Z.).
Carbenicillin di-Sodium salt | Sigma-Aldrich | C1389-5G | Antibiotic |
Streptomycin Sulphate salt | Sigma-Aldrich | S6501-50G | Antibiotic |
Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) | Sigma-Aldrich | I6758-10G | Inducer for RNAi plates |
Sodium Chloride (NaCl) | Sigma-Aldrich | 71380-1KG-M | Used in S basal, and NGM agar |
di-Potassium Hydrogen Phosphate(K2HPO4) | Sigma-Aldrich | 1.05104.1000 | Used in S basal, and NGM agar |
Potassium di-Hydrogen Phosphate (KH2PO4) | Sigma-Aldrich | P9791-1KG | Used in S basal, and NGM agar |
Magnesium Sulphate (MgSO4) | Sigma-Aldrich | M2643-1KG | Used in NGM agar |
Calcium Chloride (CaCl2) | Sigma-Aldrich | C5670-500G | Used in NGM agar |
Sodium Hydroxide (NaOH) | Sigma-Aldrich | 71687-500G | Used for bleaching |
Pluronic-F127 | Sigma-Aldrich | P2443-1KG | Used in imaging |
Sodium Hypochlorite (NaClO) | Sigma-Aldrich | 1.05614.2500 | Used for bleaching |
LB Broth | Invitrogen | 12780052 | Used to grow bacteria |
Adavanced TC 6 cm Tissue Culture plates | Greiner Bio-One | 628960 | Plates for lifespan |
CellStar 10cm Tissue Culture plates | Greiner Bio-One | 664160 | Plates for imaging |
Low Retention P200 tips | Brandt | 732832 | Tips for handling worms in liquid |
Agar | BD | 214510 | Agar for NGM, RNAi and NSC plates |
Bacto-peptone | BD | 211820 | Peptone for NGM, RNAi and NSC plates |