Eksponering for miljøgifter kan akutt påvirke utvikling embryo. Endokrine forstyrre kjemikalier som bisphenols er kjent for å påvirke nervesystemet. Her beskriver vi en protokoll med en i vitro virveldyr (chick embryoet) nevrale nettverk-modell for å studere funksjonelle virkningen av gift eksponering på tidlig embryo.
BIS-fenoler, som bis-fenol A (BPA) og bis-fenol-S (BPS), er polymerizing agenter som er mye brukt i produksjon av plast og mange dagligdagse produkter. De er klassifisert som endokrine forstyrre forbindelser (EDC) med østradiol-lignende egenskaper. Langvarig eksponering EDCs, selv ved lave doser, har vært knyttet til forskjellige sunnhet feilene inkludert kreft og atferdsforstyrrelser infertilitet, med større sårbarhet i tidlig utviklingsmessige perioder. For å studere virkningene av BPA på utviklingen av nevrale funksjon, brukte vi et i vitro nevrale nettverk avledet fra tidlig chick embryonale hjernen som modell. Vi fant at eksponering for BPA påvirket utviklingen av nettverksaktivitet, spesielt skyter aktivitet og synkronisering. En endring i nettverksaktivitet er avgjørende koblingen mellom molekylære mål av et medikament eller sammensatte og dens effekt på atferdsdata utfallet. Flere elektrode matriser blir stadig mer nyttig verktøy for å studere effekten av legemidler på nettverk aktivitet i vitro. Det er flere systemer tilgjengelig i markedet, og selv om det er variasjoner i antall elektroder, typen og kvaliteten på elektroden matrisen og analyseprogramvare, de grunnleggende underliggende prinsippene, og dataene innhentet er den samme på tvers av forskjellige systemer. Foreløpig begrenset til analyse av todimensjonal i vitro kulturer, blir disse MEA systemer forbedret for å aktivere i vivo nettverksaktivitet i hjernen skiver. Her gir vi en detaljert protokoll for embryonale eksponering og nevrale nettverksaktivitet og synchrony, sammen med representant resultater.
4, 4-Isopropylidenediphenol, ofte referert til som bisfenol-A eller BPA, finnes en antioksidant additiv i en rekke polykarbonat og epoxy harpiks basert produkter fra thermal papir, CDer og knuse bevis glass, på innsiden belegg av drikke bokser. Selv om BPA er kjent for å være en endokrine forstyrre agent som etterligner østrogen1, har studier på dens effekter skyldes daglige casual eksponering for BPA hovedsakelig kommet ut de siste 10-15 årene. Konsekvensene av med lave nivåer av BPA eksponering er dypeste i tidlig utviklingsmessige perioder, inkludert under embryogenesis gjennom eksponering mødre2,3. In utero eksponering for kvinnelige embryo endokrine forstyrre kjemikalier har også vært knyttet til økt sykdom mottakelighet fra vaginal til brystet kreft4,5. Dyrestudier har vist eksponering for BPA fører til atypisk hjernens struktur og funksjonelle unormalt manifestert i atferd6. Som en konsekvens, har bruk av BPA i spedbarn fôring flasker blitt svartelistet av mest regulerende instanser i Europa og Nord-Amerika, inkludert FDA. For å overholde forskrifter, har mange produsenter byttet til 4, 4′-sulfonyldiphenol eller bisfenol-S (BPS). Basert på det faktum at BPA og BPS er strukturelle analoger og at siste rapportene viste sammenlignbar styrken på BPS i estrogenic transkripsjon7, er det viktig å studere toksisitet av denne sammensatte forhold til BPA.
Her beskriver vi en protokoll for å teste effekten av BPA (og andre EDCs) på nettverk av neurons bruker virveldyr modell, chick fosteret. In vitro kulturer av neurons form synaptic kontakter og generere handling potensialer (også kalt pigger). Spiking aktiviteten av disse kulturene kan registreres med flere elektrode matrise (MEA) systemer. Toppene anses å være i synkronisering når de oppstår innen 5 ms av hverandre. Første tilfeldig skyter aktivitet som til slutt synkroniserer er et viktig trekk for å utvikle nevrale nettverk8,9. Synkronisering kan måles ved hjelp av ulike metoder og flere algoritmer er beskrevet i litteraturen9,10,11. I våre analyser bruker vi en algoritme utviklet av Paiva og kolleger12 som er integrert i innspillingen programvare som kjører MEA oppkjøpet systemet. Den robuste spiking aktiviteten av embryonale chick neurons gir en prototype for å studere effekten av BPA på nettverk aktivitet13. Bruker multi elektrode matriser til skyter aktiviteten, observerte vi at BPA eksponering hemmer utviklingen av nevrale skyter synkronisering9,14. Her gir vi en detaljert metodikk for å studere BPA eksponering på chick embryoet nerveceller i kultur med representant resultater på utviklingen av nevrale skyter synkronisering i chick embryonale kulturer.
Rask vekst og utvikling som embryogenesis er særlig sårbare for de skadelige virkningene av ulike endokrine-forstyrre forbindelser inkludert BPA. Vi gir detaljert protokoller for å studere virkningene av BPA eksponering i en i vitro virveldyr nevrale nettverksmodell. Bruker denne protokollen, etablerte vi at BPA senker spike hastigheten som synkronisering indeksen i utviklingsland nevrale nettverk (figur 2AB).
Vår metode ble utviklet for å studere BPA eksponering under tidlig embryogenesis og lett kan tilpasses for å studere virkningene av andre EDCs. Embryonale neuronal kulturer fra dama er relativt enkelt å etablere forhold til andre virveldyr modeller, inkludert rotte eller mus. Dessuten, det er ingen krav til et eget dyr rom-en enkel inkubator på en laboratoriebenk er tilstrekkelig til å gjennomføre disse analyser. Vi beskrive bruken av et multi elektrode system (MEA) for å vurdere effekten av EDC, BPA, på nettverksaktivitet. Protokollene beskrevet her kan brukes på andre systemer. En viktig del av denne protokollen er opprettholdelse av sterilitet. Dette inkluderer Disseksjon av fosteret under sterile forhold-sterilisering instrumenter med 70% etanol og bruk av steril Hanks balansert salter løsningen er tilstrekkelig. Som dataene samles løpet av uker, er det viktig å opprettholde steril håndtering av tiltak. Neuronal kulturer når etablert kan kultivert langsiktig – opp til tre måneder, og er derfor nyttig for studerer langsiktige eksponering for EDCs og andre forbindelser på nevrale nettverk. En annen viktig del av denne protokollen er tiden fra disseksjon til plating. Det optimale tidspunktet er 30 min, inkludert inkubasjonstiden for vevet med trypsin. Lengre tid tatt, jo dårligere overlevelse av cellene.
Her beskriver vi en grunnleggende protokoll som kan bli brukt til vurdering av alle kjemiske eller stoff som påvirker virkemåten og nevrale funksjon. Her har vi brukt en celle tetthet av 2200 celler per mm2; men dette kan endres og andre cellen tettheter kan brukes. Generelt, har vi funnet at økende celle tetthet øker nettverksaktivitet – mer toppene på kortere tid. Metoden beskrevet, svært nyttige i vurdering effekter av kjemikalier på nettverksaktivitet har begrensninger. En av de største begrensningene av metoden er at disse i vitro kulturer er to dimensjonale ikke gjenspeiler den tredimensjonale arkitekturen av virveldyr hjernen. Dette kan løses ved hjelp av skive innspillinger. Et annet alternativ er gjelder behandlinger for utvikle chick fosteret ved betyr av et lite vindu kuttet i den brede enden av egget15, dissekere hjernen på slutten av behandlingsregime gjøre tykke snitt på en vibratome og plasser på MEA for opptak nettverksaktivitet.
Våre protokollen er viktig fordi det gir undersøkelse av effekten av EDCs på utviklingen av nettverksaktivitet og tilbyr utforskningen av mekanistisk grunnlag for effekten av disse kjemikaliene.
The authors have nothing to disclose.
Denne studien støttes av NSF (HBCU-UP forskerpris innvielsen, HRD 1401426 og EPSCoR EPS-0814251) og NIH (COBRE 1P20GM103653-01A1). K.S. støttes av et fellesskap fra Delaware INBRE-III 6404.
#5 foreceps | Fine Science Tools | 11251-10 | |
Axion Muse MEA | Axion Biosystems | M64-GL1-30Pt200 | Will be called MEA system in manuscript |
Axis Software | Axion Biosystems | Will be called recording software in the manuscript | |
BPA | Sigma-Aldrich | 239658-250g | |
curved forceps | Fine Science Tools | 11272-50 | |
EtOH | Sigma-Aldrich | 64-17-5 | |
Fertilized chicken eggs | from any local farm or Spafas | ||
HBSS | Fisher | 14170112 | |
Hemacytometer | Fisher | 02-671-6 | |
Matrigel Growth Factor Reduced, Phenol Red-Free | BD Biosciences | 356231 | Will be called Extra Cellular Matrix (ECM) in the manuscript |
Neurobasal medium | BrainBits | Nb4-500 | |
Neuroexplorer statistical software | Nex Technologies | Neuroexplorer version 5 | |
Pasteur pipettes | Fisher | 13-678-20A | |
spring scissors | Fine Science Tools | 15514-12 | |
Sylgard bottom dissection dishes | Living Systems Instrumentaion | DD-90-S-BLK-3PK | |
Trypan Blue dye | Fisher | 15-250-061 | |
Trypsin-EDTA | Fisher | 15400054 |