पर्यावरण विषाक्त पदार्थों के संपर्क में तीव्रता से भ्रूण के विकास को प्रभावित कर सकते हैं । इस तरह के bisphenols के रूप में अंत स्रावी बाधित रसायनों तंत्रिका तंत्र पर प्रतिकूल असर करने के लिए जाना जाता है । यहां हम एक इन विट्रो हड्डीवाला (चिकी भ्रूण) का उपयोग कर प्रोटोकॉल का वर्णन न्यूरॉन नेटवर्क मॉडल जल्दी भ्रूण पर विष जोखिम के कार्यात्मक प्रभाव का अध्ययन करने के लिए.
बीआईएस-phenols, जैसे बीआईएस-phenol ए (BPA) और बीआईएस-phenol-एस (बीपीएस), polymerizing एजेंटों व्यापक रूप से प्लास्टिक और कई रोजमर्रा के उत्पादों के उत्पादन में इस्तेमाल कर रहे हैं । वे एस्ट्राडियोल की तरह गुण के साथ अंत-स्रावी बाधित यौगिकों (EDC) के रूप में वर्गीकृत कर रहे हैं । EDCs के लिए दीर्घकालिक जोखिम, यहां तक कि कम मात्रा में, कैंसर, व्यवहार विकारों सहित विभिंन स्वास्थ्य दोषों के साथ जोड़ा गया है, और बांझपन, जल्दी विकास के समय के दौरान अधिक जोखिम के साथ । के विकास पर BPA के प्रभाव का अध्ययन करने के लिए ंयूरॉन समारोह, हम एक में इस्तेमाल किया इन विट्रो न्यूरॉन एक मॉडल के रूप में जल्दी लड़की भ्रूण मस्तिष्क से व्युत्पंन नेटवर्क. हमने पाया है कि BPA के लिए जोखिम नेटवर्क गतिविधि, विशेष रूप से spiking गतिविधि और तुल्यकालन के विकास को प्रभावित किया । नेटवर्क गतिविधि में परिवर्तन एक दवा या यौगिक और व्यवहार के परिणाम पर उसके प्रभाव के आणविक लक्ष्य के बीच महत्वपूर्ण कड़ी है । बहु इलेक्ट्रोड arrays तेजी से उपयोगी उपकरण बनने के लिए इन विट्रो मेंनेटवर्क गतिविधि पर दवाओं के प्रभाव का अध्ययन कर रहे हैं । वहां कई बाजार में उपलब्ध प्रणालियों रहे है और, हालांकि वहां इलेक्ट्रोड की संख्या में भिंनता है, प्रकार और इलेक्ट्रोड सरणी और विश्लेषण सॉफ्टवेयर की गुणवत्ता, मूल अंतर्निहित सिद्धांतों, और डेटा प्राप्त भर में एक ही है विभिंन प्रणालियों । हालांकि वर्तमान में दो के विश्लेषण के लिए सीमित विट्रो संस्कृतियों में आयामी, इन मेे सिस्टम को मस्तिष्क स्लाइस में vivo नेटवर्क गतिविधि में सक्षम सुधार किया जा रहा है । यहां, हम भ्रूण जोखिम और रिकॉर्डिंग के लिए एक विस्तृत प्रोटोकॉल प्रदान ंयूरॉंस नेटवर्क गतिविधि और synchrony, साथ प्रतिनिधि परिणामों के साथ ।
4, 4 ‘-Isopropylidenediphenol, आमतौर पर Bisphenol के रूप में निर्दिष्ट-एक या BPA, एक एंटी ऑक्सीडेंट है पाली कार्बोनेट और epoxy राल आधारित थर्मल पेपर, सीडी से लेकर उत्पादों की एक विस्तृत विविधता में पाया, और चकनाचूर सबूत कांच के अंदर कोटिंग के लिए, पेय के डिब्बे । हालांकि bpa के लिए एक अंत-स्रावी बाधित एजेंट है कि1एस्ट्रोजन नकल करता है ज्ञात किया गया है, इसके बीमार BPA के लिए हर रोज आकस्मिक जोखिम के कारण प्रभाव पर अध्ययन ज्यादातर पिछले 10 में बाहर आ गए हैं-15 साल. BPA जोखिम के भी कम स्तर के परिणाम जल्दी विकास के समय में सबसे गहरा है, माताओं के जोखिम के माध्यम से embryogenesis के दौरान सहित2,3। अंत में स्रावी बाधित रसायनों के लिए महिला भ्रूण के जोखिम में utero भी योनि से स्तन कैंसर के लिए4,5में वृद्धि रोग संवेदनशीलता को जोड़ा गया है । पशु अध्ययनों से प्रदर्शन किया है BPA के लिए जोखिम असामान्य मस्तिष्क संरचना और कार्यात्मक असामान्यताओं में प्रकट होता है6. एक परिणाम के रूप में, शिशु खिला बोतलों में BPA के उपयोग के अधिकांश नियामक एजेंसियों द्वारा यूरोप और उत्तरी अमेरिका, एफडीए सहित पर प्रतिबंध लगा दिया गया है । विनियमों के साथ अनुपालन करने के लिए, कई निर्माताओं 4, 4 ‘-sulfonyldiphenol या bisphenol-S (बीपीएस) के लिए बंद कर दिया है. तथ्य यह है कि bpa और बीपीएस संरचनात्मक अनुरूप है और हाल ही में रिपोर्ट के आधार पर एस्ट्रोजन प्रतिलेखन में बीपीएस के तुलनीय शक्ति दिखाया7, यह BPA के सापेक्ष इस यौगिक की विषाक्तता का अध्ययन करने के लिए महत्वपूर्ण है.
यहां हम एक प्रोटोकॉल का वर्णन करने के लिए BPA के प्रभाव का परीक्षण (और अंय EDCs) ंयूरॉंस के नेटवर्क पर एक हड्डीवाला मॉडल, चिकी भ्रूण का उपयोग कर । इन विट्रो में न्यूरॉन्स की संस्कृतियों फार्म synaptic संपर्कों और उत्पन्न कार्रवाई की क्षमता (spikes भी कहा जाता है). इन संस्कृतियों के spiking गतिविधि बहु इलेक्ट्रोड सरणी (मेे) प्रणालियों का उपयोग कर दर्ज किया जा सकता है । spikes synchrony में माना जाता है जब वे एक दूसरे के 5 ms के भीतर होते हैं । प्रारंभिक यादृच्छिक spiking गतिविधि है कि अंततः सिंक्रनाइज़ ंयूरॉंस नेटवर्क8,9के विकास की एक महत्वपूर्ण विशेषता है । Synchrony विभिंन तरीकों का उपयोग कर मापा जा सकता है और कई एल्गोरिदम साहित्य में वर्णित है9,10,11। हमारे विश्लेषण में, हम एक Paiva और सह द्वारा विकसित एल्गोरिथ्म का उपयोग करें12 जो रिकॉर्डिंग सॉफ्टवेयर में एकीकृत है जो विदेश मंत्रालय अधिग्रहण प्रणाली ड्राइव । भ्रूण लड़की ंयूरॉंस की मजबूत spiking गतिविधि तंत्रिका नेटवर्क गतिविधि13पर BPA के प्रभाव का अध्ययन करने के लिए एक प्रोटोटाइप प्रदान करता है । बहु इलेक्ट्रोड arrays का प्रयोग spiking गतिविधि रिकॉर्ड करने के लिए, हमने देखा है कि BPA जोखिम ंयूरॉन spiking synchrony9,14के विकास को रोकता है । यहाँ, हम लड़की भ्रूण संस्कृतियों में न्यूरॉन spiking synchrony के विकास पर प्रतिनिधि परिणामों के साथ साथ संस्कृति में चिकी पर BPA जोखिम का अध्ययन करने के लिए एक विस्तृत पद्धति प्रदान करते हैं.
तेजी से विकास और embryogenesis के रूप में विकास के चरणों विशेष रूप से BPA सहित विभिन्न अंत-स्रावी बाधित यौगिकों के हानिकारक प्रभाव के लिए संवेदनशील हैं. हम एक में इन विट्रो हड्डीवाला ंयूरॉंस नेटवर्क मॉडल में BPA जोखिम के प्रभाव का अध्ययन करने के लिए विस्तृत प्रोटोकॉल प्रदान करते हैं । इस प्रोटोकॉल का प्रयोग, हम स्थापित किया है कि BPA कील दर के रूप में के रूप में अच्छी तरह से विकासशील ंयूरॉंस नेटवर्क में synchrony सूचकांक (चित्रा 2ए बी) कम करती है ।
हमारी कार्यप्रणाली जल्दी embryogenesis के दौरान BPA जोखिम का अध्ययन करने के लिए डिज़ाइन किया गया था और आसानी से अंय EDCs के प्रभाव का अध्ययन करने के लिए अनुकूलित किया जा सकता है । लड़की से भ्रूण ंयूरॉन संस्कृतियों अपेक्षाकृत आसान अंय हड्डीवाला मॉडल, चूहे या माउस सहित की तुलना में स्थापित कर रहे हैं । इसके अलावा, वहां एक अलग पशु कमरे के लिए कोई आवश्यकता नहीं है-एक प्रयोगशाला पीठ पर एक सरल मशीन के लिए इन परख बाहर ले पर्याप्त है । हम नेटवर्क गतिविधि पर EDC, BPA के प्रभाव का आकलन करने के लिए एक बहु-इलेक्ट्रोड प्रणाली (मेे) के उपयोग का वर्णन करते हैं । यहां बताए गए प्रोटोकॉल अंय सिस्टंस पर लागू किए जा सकते हैं । इस प्रोटोकॉल का एक महत्वपूर्ण पहलू बांझपन का रखरखाव है । यह बाँझ शर्तों के तहत भ्रूण के विच्छेदन-७०% इथेनॉल और बाँझ हांक संतुलित लवण समाधान के उपयोग के साथ उपकरणों को निष्फल करने के लिए पर्याप्त है शामिल हैं । के रूप में डेटा सप्ताह की अवधि में एकत्र की है, यह महत्वपूर्ण है बाँझ की हैंडलिंग बनाए रखने के लिए रहत । एक बार की स्थापना की ंयूरॉंस संस्कृतियों लंबे समय तक किया जा सकता है अवधि-अप करने के लिए तीन महीने-और इस तरह के अध्ययन के लिए उपयोगी है दीर्घकालिक जोखिम EDCs और अंय यौगिकों के लिए ंयूरॉंस नेटवर्किंग पर । इस प्रोटोकॉल का एक अंय महत्वपूर्ण पहलू विच्छेदन से समय चढ़ाना है । इष्टतम समय trypsin के साथ ऊतक की मशीन सहित 30 मिनट, है । अब समय ले लिया, गरीब कोशिकाओं का अस्तित्व ।
हम यहां एक बुनियादी प्रोटोकॉल है कि किसी भी रासायनिक या दवा है कि व्यवहार और तंत्रिका समारोह को प्रभावित करता है के आकलन के लिए लागू किया जा सकता का वर्णन । यहां, हम २,२०० प्रति मिमी कोशिकाओं के एक सेल घनत्व का इस्तेमाल किया है2; हालांकि, यह संशोधित किया जा सकता है और अंय कक्ष घनत्व उपयोग किया जा सकता है । सामांय में, हमने पाया है कि बढ़ती सेल घनत्व बढ़ जाती है नेटवर्क गतिविधि-एक छोटे समय में अधिक spikes । विधि वर्णित है, हालांकि नेटवर्क गतिविधि पर रसायनों के प्रभाव का आकलन करने में बहुत उपयोगी सीमाओं है । विधि की सबसे बड़ी सीमाओं में से एक यह है कि इन विट्रो संस्कृतियों में दो आयामी हड्डीवाला मस्तिष्क के तीन आयामी वास्तुकला को प्रतिबिंबित नहीं कर सकते हैं । स्लाइस रिकॉर्डिंग का उपयोग करके इसे दूर किया जा सकता है । एक अंय विकल्प के लिए एक छोटी सी खिड़की के माध्यम से विकासशील चिकी भ्रूण को उपचार लागू है15, उपचार आहार के अंत में मस्तिष्क काटना, एक vibratome पर मोटी वर्गों बनाने के लिए, और जगह पर विदेश मंत्रालय के लिए रिकॉर्डिंग नेटवर्क गतिविधि ।
हमारे प्रोटोकॉल में महत्वपूर्ण है कि यह नेटवर्क गतिविधि के विकास पर EDCs के प्रभाव की परीक्षा में सक्षम बनाता है और इन रसायनों के प्रभाव के लिए एक यंत्रवत आधार की खोज प्रदान करता है ।
The authors have nothing to disclose.
इस अध्ययन को NSF (HBCU रिसर्च दीक्षा पुरस्कार, एचआरडी १४०१४२६ और EPSCoR ईपीएस-०८१४२५१) और NIH (COBRE 1P20GM103653-01A1) ने समर्थन दिया है । कृष्णसिंह डेलावेयर INBRE-III ६४०४ से एक फैलोशिप द्वारा समर्थित है ।
#5 foreceps | Fine Science Tools | 11251-10 | |
Axion Muse MEA | Axion Biosystems | M64-GL1-30Pt200 | Will be called MEA system in manuscript |
Axis Software | Axion Biosystems | Will be called recording software in the manuscript | |
BPA | Sigma-Aldrich | 239658-250g | |
curved forceps | Fine Science Tools | 11272-50 | |
EtOH | Sigma-Aldrich | 64-17-5 | |
Fertilized chicken eggs | from any local farm or Spafas | ||
HBSS | Fisher | 14170112 | |
Hemacytometer | Fisher | 02-671-6 | |
Matrigel Growth Factor Reduced, Phenol Red-Free | BD Biosciences | 356231 | Will be called Extra Cellular Matrix (ECM) in the manuscript |
Neurobasal medium | BrainBits | Nb4-500 | |
Neuroexplorer statistical software | Nex Technologies | Neuroexplorer version 5 | |
Pasteur pipettes | Fisher | 13-678-20A | |
spring scissors | Fine Science Tools | 15514-12 | |
Sylgard bottom dissection dishes | Living Systems Instrumentaion | DD-90-S-BLK-3PK | |
Trypan Blue dye | Fisher | 15-250-061 | |
Trypsin-EDTA | Fisher | 15400054 |