Exponering för miljögifter kan akut påverka utvecklingsländer embryon. Hormonstörande kemikalier såsom bisphenols är kända för att påverka nervsystemet. Här beskriver vi ett protokoll som använder en neuronala nätverk i vitro ryggradsdjur (chick embryo) modell för att studera de funktionella effekterna av toxin exponering på tidiga embryon.
BIS-fenoler, t ex bis-fenol A (BPA) och bis-fenol-S (BPS), polymeriserande agenter som ofta används i tillverkningen av plaster och många vardagliga produkter. De klassificeras som endokrina störningar föreningar (EDC) med estradiol-liknande egenskaper. Långvarig exponering för hormonstörande ämnen, även vid låga doser, har kopplats till olika hälsa defekter inklusive cancer, beteendestörningar och infertilitet, med större sårbarhet under tidig utvecklingsmässiga perioder. För att studera effekterna av BPA på utvecklingen av nervcellernas funktion, använde vi en in vitro- neuronala nätverk härrör från tidigt chick embryonala hjärnan som modell. Vi hittade att exponering för BPA påverkade utvecklingen av nätverksaktivitet, särskilt tillsatta aktivitet och synkronisering. En förändring i nätverksaktivitet är den avgörande länken mellan det molekylära målet av en drog eller sammansatta och dess effekt på beteendemässiga resultatet. Multi elektrod arrayer blir alltmer användbara verktyg för att studera effekterna av droger på nätverket aktivitet in vitro. Det finns flera system på marknaden och, även om det finns variationer i antalet elektroder, typ och kvalitet av den elektrod arrayen och analys programvara, grundläggande principer, och uppgifterna samlats in är detsamma över den olika system. För närvarande begränsad till analys av tvådimensionella in vitro- kulturer, men dessa MEA system förbättras om du vill aktivera i vivo nätverksaktivitet i hjärnan skivor. Här, ger vi ett detaljerat protokoll för embryonala exponering och inspelning neuronala nätverksaktivitet och synchrony, tillsammans med representativa resultat.
4, 4 ‘-isopropylidendifenol, vanligen avses som bisfenol-A eller BPA, är en antioxidant tillsats finns i ett brett utbud av polykarbonat och epoxi harts baserad produkter alltifrån termiskt papper, CD-skivor, och shatter proof glas, på insidan beläggning av dryck burkar. Även om BPA har varit känt att vara en endokrina störningar agent som härmar östrogen1, har studier på dess skadeverkningar på grund av vardagliga casual exponering för BPA mestadels kommit under de senaste 10 – 15 åren. Konsekvenserna av även låga nivåer av BPA exponering är mest djupgående i tidig utvecklingsmässiga perioder, inklusive under embryogenes genom exponering av mödrar2,3. In utero exponering av kvinnliga embryon för hormonstörande kemikalier har också kopplats till ökad mottaglighet från vaginal till breast cancer4,5. Djurstudier har visat att exponering för BPA leder till atypiska hjärnans struktur och funktionella avvikelser manifesteras i beteende6. Användning av BPA i nappflaskor har följaktligen förbjudits av mest tillsynsmyndigheter i Europa och Nordamerika, inklusive FDA. För att följa bestämmelser, har många tillverkare gått över till 4, 4′-sulfonyldiphenol eller bisfenol-S (BPS). Bygger på det faktum att BPA och BPS är strukturella analoger och att senaste rapporterna visade jämförbar styrka av BPS i östrogena transkription7, är det viktigt att studera toxiciteten av denna sammansatta släkting till BPA.
Här beskriver vi ett protokoll för att testa effekterna av BPA (och andra hormonstörande ämnen) på nätverk av nervceller som använder en vertebrate modell, chick embryot. In vitro kulturer av nervceller bildar synaptiska kontakter och generera handlingspänningar (även kallad spikar). Tillsatta aktiviteten av dessa kulturer kan registreras med hjälp av multi elektrod array (MEA) system. Spikar anses vara synkront när de inträffar inom 5 ms av varandra. Inledande slumpmässigt tillsatta aktivitet som så småningom synkroniserar är en nyckelfunktion för att utveckla neuronala nätverk8,9. Synchrony kan mätas med olika metoder och flera algoritmer beskrivs i litteraturen9,10,11. I våra analyser använder vi en algoritm som utvecklats av Paiva och medarbetare12 som är integrerad i inspelningsprogrammet som driver MEA förvärvsystemet. Robust tillsatta aktiviteten av embryonala chick nervceller ger en prototyp för att studera effekten av BPA på neurala nätverk aktivitet13. Använda flera elektrod-matriser för att spela in tillsatta aktivitet, observerat vi att BPA exponering hämmar utvecklingen av neuronala tillsatta synchrony9,14. Här ger vi en detaljerad metod för att studera BPA exponering på chick embryo neuroner i kultur tillsammans med representativa resultat på utvecklingen av neuronala tillsatta synchrony i chick embryonala kulturer.
Faser av snabb tillväxt och utveckling såsom embryogenes är särskilt känsliga för de skadliga effekterna av olika hormonstörande ämnen inklusive BPA. Vi tillhandahåller detaljerade protokoll för att studera effekterna av BPA exponering i en in vitro- ryggradsdjur neuronala nätverksmodell. Använder det här protokollet, etablerat vi att BPA sänker andelen spike samt synchrony index i de framkallande neuronala nätverk (figur 2a-b).
Vår metod var att studera BPA exponering under tidig embryogenes och kan enkelt anpassas för att studera effekterna av andra hormonstörande ämnen. Embryonala neuronala kulturer från ungen är relativt lätt att fastställa jämfört andra ryggradsdjur modeller, inklusive råtta eller mus. Dessutom finns det inget krav på ett separat djur rum — en enkel inkubator på en arbetsbänk är tillräckligt att utföra dessa analyser. Vi beskriver användningen av ett multi elektrod system (MEA) för att bedöma effekten av EDC, BPA, på nätverksaktivitet. De protokoll som beskrivs här kan tillämpas på andra system. En viktig aspekt av detta protokoll är upprätthållande av sterilitet. Detta inkluderar dissekering av embryot under sterila förhållanden — sterilisera instrument med 70% etanol och användning av sterila Hanks balanserad salter lösning är tillräcklig. När data samlas in under en period av veckor, är det viktigt att upprätthålla steril hantering av de multilaterala miljöavtal. De neuronala kulturer när etablerat kan vara odlade långsiktiga – upp till tre månader — och således är användbara för att studera långsiktiga exponering för hormonstörande ämnen och andra föreningar på neuronala nätverk. En annan viktig aspekt av detta protokoll är tiden från dissektion till bordläggningen. Den optimala tiden är 30 min, inklusive inkubering av vävnaden med trypsin. Ju längre den tid det tar, desto sämre överlevnad av cellerna.
Här beskriver vi ett grundläggande protokoll som kan tillämpas för bedömningen av någon kemikalie eller läkemedel som påverkar beteende och neurala funktion. Här har vi använt en cell densiteten av 2.200 celler per mm2. men detta kan ändras och andra cell tätheter kan användas. I allmänhet har vi funnit att ökar cell densiteten ökar nätverksaktivitet – fler spikar på kortare tid. Metoden beskrivs, även om det är mycket användbart i bedömningen av verkningarna av kemikalier på nätverksaktivitet har begränsningar. En av de största begränsningarna för metoden är att dessa in vitro-kulturer är tvådimensionell inte kanske återspeglar den tredimensionella arkitekturen av vertebrate hjärnan. Detta kan lösas med hjälp av segment inspelningar. Ett annat alternativ är att tillämpa behandlingarna på det växande chick embryot av innebär i ett litet fönster skära på den breda änden av ägget15, dissekerar hjärnan i slutet av behandlingsregim, göra tjock sektioner på en vibratome och placera på MEA för inspelning nätverksaktivitet.
Våra protokoll är betydande eftersom det möjliggör granskning av effekten av hormonstörande ämnen på utvecklingen av nätverksaktivitet och erbjuder utforskandet av mekanistiska grund för effekterna av dessa kemikalier.
The authors have nothing to disclose.
Denna studie stöds av NSF (HBCU-UP forskning inledande Award, HRD 1401426 och EPSCoR EPS-0814251) och NIH (COBRE 1P20GM103653-01A1). K.S. stöds av ett stipendium från den Delaware INBRE-III 6404.
#5 foreceps | Fine Science Tools | 11251-10 | |
Axion Muse MEA | Axion Biosystems | M64-GL1-30Pt200 | Will be called MEA system in manuscript |
Axis Software | Axion Biosystems | Will be called recording software in the manuscript | |
BPA | Sigma-Aldrich | 239658-250g | |
curved forceps | Fine Science Tools | 11272-50 | |
EtOH | Sigma-Aldrich | 64-17-5 | |
Fertilized chicken eggs | from any local farm or Spafas | ||
HBSS | Fisher | 14170112 | |
Hemacytometer | Fisher | 02-671-6 | |
Matrigel Growth Factor Reduced, Phenol Red-Free | BD Biosciences | 356231 | Will be called Extra Cellular Matrix (ECM) in the manuscript |
Neurobasal medium | BrainBits | Nb4-500 | |
Neuroexplorer statistical software | Nex Technologies | Neuroexplorer version 5 | |
Pasteur pipettes | Fisher | 13-678-20A | |
spring scissors | Fine Science Tools | 15514-12 | |
Sylgard bottom dissection dishes | Living Systems Instrumentaion | DD-90-S-BLK-3PK | |
Trypan Blue dye | Fisher | 15-250-061 | |
Trypsin-EDTA | Fisher | 15400054 |