هندسة أنسجة القرنية: في المختبر نموذجا للتفاعلات Stromal العصب القرنية البشرية
Summary
ويصف هذا البروتوكول رواية ثلاثية الأبعاد في المختبر نموذجا، حيث القرنية الخلايا اللحمية والخلايا العصبية متمايزة مثقف معا المساعدة في دراسة وفهم التفاعلات بين أنواع الخلايا اثنين.
Abstract
هندسة الأنسجة اكتسبت اعترافاً كبيرا بسبب الطلب المرتفع على استبدال القرنية البشرية مع حوالي 10 مليون شخص في العالم يعانون من فقدان الرؤية القرنية1. لمواجهة الطلب على القرنيات البشرية قابلة للاستمرار، إحراز تقدم كبير في الأنسجة (3D) ثلاثي الأبعاد الهندسية جعلت2،،من34. هذه القرنية النماذج مجموعة من أنظمة أحادي الطبقة البسيطة لنماذج متعددة الطبقات، مما يؤدي إلى 3D كاملة-سمك القرنية مكافئات2.
ومع ذلك، استخدام القرنية 3D هندسة الأنسجة في السياق في المختبر نماذج المرض درس للتاريخ يفتقر إلى تشابه هيكل متعدد الطبقات 3D أنسجة القرنية والدالة، والربط الشبكي لأنواع مختلفة من الخلايا (أي، العصبية، ظهارة وسدى، والبطانة)2،3. وباﻹضافة إلى ذلك، زاد الطلب على الأنسجة في المختبر القرنية في نماذج في محاولة للحد من التجارب الحيوانية للمنتجات الصيدلانية. وهكذا، نماذج أكثر تطورا مطالبون بتطابق أفضل نظم للاحتياجات الفيزيولوجية البشرية، وتطوير نموذج أكثر ملاءمة للسكان المريض ضرورية للغاية. نظراً لأن العديد من أنواع الخلايا في القرنية المتأثرة بالأمراض وضمور، مثل القرنية المخروطية والسكري كيراتوباثي فوكس، يشمل هذا النموذج نموذج 3D ثقافة المشارك الرئيسي القرنية البشرية الليفية (هكفس) من الجهات المانحة صحية والخلايا العصبية من ش-SY5Y خط الخلية. وهذا يسمح لنا للمرة الأولى للتحقيق في التفاعلات بين أنواع الخلايا اثنين داخل أنسجة القرنية البشرية. ونحن نعتقد أن هذا النموذج يمكن أن يحتمل أن تشريح الآليات الكامنة المرتبطة بتفاعلات stromal الأعصاب أمراض القرنية الذي يحمل الأضرار العصبية. مرايا الطبيعة التشريحية والفسيولوجية الأساسية لانسجة القرنية في فيفو هذا النموذج الثلاثي الأبعاد ويمكن استخدامها في المستقبل كأداة للتحقيق في عيوب القرنية، فضلا عن فحص مدى فعالية مختلف العوامل قبل إجراء التجارب الحيوانية.
Introduction
في جسم الإنسان، هو القرنية الأنسجة الأكثر كثافة إينيرفاتيد. الأعصاب هي المسؤولة عن مختلف الأحاسيس مثل اللمس، الألم، ودرجة الحرارة، ولها أيضا دور أساسي في التئام الجروح، ووميض ردود الفعل، المسيل للدموع إنتاج وإفراز5،،من67. في القرنية، تنشأ من الضفيرة حوفي stromal العصب جذوع وأدخل سدى القرنية الطرفية إشعاعيا. المنظمة العصب stromal موازية ل lamellae الكولاجين، وهم كذلك فرع في كراسات أصغر حجماً كما أنها تمضي نحو5،ستروما سطحية8. الألياف العصبية كذلك اختراق الطبقة الظهارية وهكذا، تعصيب على نطاق واسع ينتشر عبر ظهارة القرنية وسدى. ولذلك، تعصيب دوراً أساسيا في حالة صحية والمريضة للقرنية. في هذا البروتوكول، تكشف لنا النهوض برواية ثلاثية الأبعاد في المختبر نموذجا، وهو أول نوعه لمحاكاة التفاعلات stromal الأعصاب في الجسم الحي . واستخدمت خط الخلية SH-SY5Y لهذه الدراسة، كما أنها واحدة من الخطوط الأكثر رسوخا، وكذلك تتسم المستخدمة لدراسة نمو الخلايا العصبية. قد وصفت خط الخلية SH-SY5Y لإنتاج كلا ملتصقة الركازة (S-نوع) ونيوروبلاستيك (من نوع N) الخلايا التي يمكن أن تخضع ترانسديفيرينتييشن9. كنتيجة لذلك، على الرغم من أن هذا الخط خلية مشتق من مجموعة سوبكلون متعاقبة ثلاثي ن نوع الخلايا، فإنه يحتوي أيضا على عدد صغير من S-نوع الخلايا قادرة على يمر بالتمايز إلى الخلايا العصبية من خلال استخدام الريتينويك الحمضية والمستمدة من الدماغ عامل نيوروتروفيك9. وهذا يوفر أداة يمكن أن تؤدي إلى فهم أفضل لمضاعفات القرنية المرتبطة باعتلال الشبكية السكري (مارك ألماني) وغيرها من أمراض العين. بسبب الصعوبات المرتبطة بالحصول على واستزراع الخلايا العصبية من المرضى المصابين بأمراض العين، يوفر هذا النموذج ثلاثي الأبعاد في المختبر آثار كبيرة في دراسة التفاعلات بين الخلايا العصبية والإشارات مع سدى القرنية.
وكثيراً ما تؤثر ظروف المريضة مختلف أنسجة الجسم على نطاق واسع جداً، مما يؤدي إلى نوعية حياة الشبهة. ضمور العين هي المضاعفات المشتركة غالباً ما ترتبط مع الأمراض الجهازية ويؤدي إلى فقدان البصر أو فقدان الرؤية حتى الدائمة. دراسات شاملة غالباً ما تكون ضرورية لفهم أفضل لحالة المرض، فضلا عن آثار على المستوى الخلوي القاعدية. قد وضعت نماذج مختلفة في الجسم الحي وفي المختبر دراسة آثار تلك الأمراض، مع مساعدة الأنسجة التطبيقات الهندسية. تطبيقات هندسة الأنسجة القرنية قد حصل على اهتمام كبير عبر مختلف ميادين العلوم10،،من1112،،من1314، ولكن هناك قيود لا تزال كبيرة خلال التطبيق الفعلي، بما في ذلك القرنية graft الرفض، والالتهابات، و تندب10،11،،،من1213،14. وهناك العديد من الدراسات التي نجحت في تطوير وإنشاء مختلف في المختبر نماذج3،،من1516،،من1718، 1920،،،من2123،22،24،،من2526. نماذج ثلاثية الأبعاد في المختبر هي الواعدة وذات أهمية علمية كبيرة. من المعروف أن أفضل مرآة في فيفو الخلوية والفسيولوجية الأحداث التي هي حاسمة خلال التليف والجرح الشفاء15،27،،من2829نماذج ثلاثية الأبعاد. هذه النماذج في المختبر يلعب دوراً أساسيا في إيجاد نهج علاجية جديدة لعلاج الحالات المرضية المختلفة بما في ذلك مضاعفات القرنية. وعلى الرغم من الدور الحاسم الذي تؤديه تعصيب في وظائف القرنية، أحرز القليل من الجهد لتعزيز انتشار الأعصاب الطرفية داخل القرنية بنيات هندسة الأنسجة2،3. بيد تحاكي بنيات خلية المقترحة 3D في المختبر الأنسجة المستهدفة بغية تحقيق وظائف الأنسجة المرجوة.
بينما كيراتوباثي السكري تطبيق واضح لنموذج الموضحة هنا بسبب العيوب العصبية، وهناك عدة أمراض القرنية الأخرى يمكن أن تستفيد من نموذج بشرية في المختبر بما في ذلك ضمور القرنية المخروطية وفوكس. لدينا نموذج ثلاثي الأبعاد ينبثق من هذا الاحتمال، ويقترح تطوير تمثيل في المختبر من أنسجة القرنية لتقييم إيصال الأدوية وسلامة الأدوية العين الجديدة.
Protocol
Representative Results
Discussion
العديد من الدراسات ركزت على تطوير النماذج الحيوانية المختلفة التي يمكن أن تساعد في تطوير فهم أفضل لأمراض القرنية فضلا عن اكتشاف العلاجات. ومع ذلك، لم يتم التحقق قيمة كبيرة للبشر من هذه الدراسات. حتى الآن، تم وضع نماذج مختلفة في المختبر والتحقيق على نطاق واسع نظراً لأهميتها السريرية م…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
نود أن أتقدم بخالص الشكر إلى الدكتور بن فاولر لمساعدته التقنية مع تجارب ال.
Materials
| Healthy corneal tissue | NDRI | Samples from donors with no ocular trauma or systemic disease | |
| Dulbecco’s Phosphate Buffered Solution (1X) | Gibco by Life Technologies | 14190-144 | |
| Sterile forceps | Fischer Scientific | 13-812-42 | Fisherbrand Dissecting Extra-Fine-Pointed Splinter Forceps |
| Single edge razor blades | Personna | 270100 | |
| Sterile surgical scalpel blades No.10 | Feather Surgical Blade | 2976#10 | |
| Eagle’s Minimum Essential Medium | ATCC | 30-2003 | |
| Fetal Bovine Serum | Atlanta Biologicals | S11550 | 10% FBS is required for media preparation |
| Antibiotic-Antimycotic (100X) | Gibco by Life Technologies | 15240-062 | 1% Antibiotic-Antimycotic is required for media preparation |
| 0.05% Trypsin EDTA(1X) | Gibco by Life Technologies | 25300062 | |
| Polycarbonate membrane inserts with 0.4-μm pores | Corning Costar | 3412 | |
| 2-O-α-Dglucopyranosyl-L-ascorbic acid (Vitamin C) | Sigma-Aldrich | SMB00390-14 | A concentration of 0.5 mM should be used for the study |
| Wax block | VWR | 50-949-027 | |
| SH-SY5Y Neuroblastoma cells | ATCC | SHSY5YATCC CRL-2266 | |
| Retinoic Acid | Sigma-Aldrich | SRP3014-10UG | Final concentration of 10uM needs to be used |
| BDNF | Sigma-Aldrich | R2625-100MG | Final concentration of 2nM needs to be used |
| Dimethyl Sulfoxide(DMSO) | VWR-Alfa Aesar | 67-68-5 | Ultra Pure Grade-Sterile DMSO to be used |
| Thermo Scientific Nunc Cell Culture Treated EasYFlasks (T25) | Fisher Scientific | 12-565-351 | |
| Thermo Scientific Nunc Cell Culture Treated EasYFlasks (T75) | Fisher Scientific | 12-565-349 |
Referências
- Pascolini, D., Mariotti, S. P. Global estimates of visual impairment: 2010. Br J Ophthalmol. 96 (5), 614-618 (2012).
- Rönkkö, S., Vellonen, K. -. S., Järvinen, K., Toropainen, E., Urtti, A. Human corneal cell culture models for drug toxicity studies. Drug Delivery and Translational Research. 6 (6), 660-675 (2016).
- Ghezzi, C. E., Rnjak-Kovacina, J., Kaplan, D. L. Corneal tissue engineering: recent advances and future perspectives. Tissue Eng Part B Rev. 21 (3), 278-287 (2015).
- Shafaie, S., Hutter, V., Cook, M. T., Brown, M. B., Chau, D. Y. S. In Vitro Cell Models for Ophthalmic Drug Development Applications. BioResearch Open Access. 5 (1), 94-108 (2016).
- Shaheen, B. S., Bakir, M., Jain, S. Corneal nerves in health and disease. Surv Ophthalmol. 59 (3), 263-285 (2014).
- Beuerman, R. W., Schimmelpfennig, B. Sensory denervation of the rabbit cornea affects epithelial properties. Exp Neurol. 69 (1), 196-201 (1980).
- Heigle, T. J., Pflugfelder, S. C. Aqueous tear production in patients with neurotrophic keratitis. Cornea. 15 (2), 135-138 (1996).
- Wang, S., et al. In vitro 3D corneal tissue model with epithelium, stroma, and innervation. Biomaterials. 112, 1-9 (2017).
- Ross, R. A., Spengler, B. A., Biedler, J. L. Coordinate morphological and biochemical interconversion of human neuroblastoma cells. J Natl Cancer Inst. 71 (4), 741-747 (1983).
- Griffith, L. G., Naughton, G. Tissue engineering – Current challenges and expanding opportunities. Science. 295 (5557), (2002).
- Guo, X., et al. Morphologic characterization of organized extracellular matrix deposition by ascorbic acid-stimulated human corneal fibroblasts. Invest Ophthalmol Vis Sci. 48 (9), 4050-4060 (2007).
- Karamichos, D. Ocular tissue engineering: current and future directions. J Funct Biomater. 6 (1), 77-80 (2015).
- Karamichos, D., Brown, R. A., Mudera, V. Collagen stiffness regulates cellular contraction and matrix remodeling gene expression. J Biomed Mater Res A. 83 (3), 887-894 (2007).
- Ruberti, J. W., Zieske, J. D. Prelude to corneal tissue engineering – gaining control of collagen organization. Prog Retin Eye Res. 27 (5), 549-577 (2008).
- Karamichos, D., Guo, X. Q., Hutcheon, A. E., Zieske, J. D. Human corneal fibrosis: an in vitro model. Invest Ophthalmol Vis Sci. 51 (3), 1382-1388 (2010).
- Chen, F. M., Liu, X. Advancing biomaterials of human origin for tissue engineering. Prog Polym Sci. 53, 86-168 (2016).
- Priyadarsini, S., Sarker-Nag, A., Rowsey, T. G., Ma, J. X., Karamichos, D. Establishment of a 3D In Vitro Model to Accelerate the Development of Human Therapies against Corneal Diabetes. PLoS One. 11 (12), e0168845 (2016).
- Karamichos, D., Hjortdal, J. Keratoconus: tissue engineering and biomaterials. J Funct Biomater. 5 (3), 111-134 (2014).
- Wilson, S. L., Yang, Y., El Haj, A. J. Corneal Stromal Cell Plasticity: In Vitro Regulation of Cell Phenotype Through Cell-Cell Interactions in a Three-Dimensional Model. Tissue Engineering Part A. 20 (1-2), 225-238 (2014).
- Proulx, S., et al. Reconstruction of a human cornea by the self-assembly approach of tissue engineering using the three native cell types. Molecular Vision. 16 (234-236), 2192-2201 (2010).
- Gonzalez-Andrades, M., et al. Establishment of a novel in vitro model of stratified epithelial wound healing with barrier function. Sci Rep. 6, 19395 (2016).
- Hopkins, A. M., DeSimone, E., Chwalek, K., Kaplan, D. L. 3D in vitro modeling of the central nervous system. Prog Neurobiol. 125, 1-25 (2015).
- Schulz, S., et al. Natural Corneal Cell-Based Microenvironment as Prerequisite for Balanced 3D Corneal Epithelial Morphogenesis: A Promising Animal Experiment-Abandoning Tool in Ophthalmology. Tissue Engineering Part C-Methods. 20 (4), 297-307 (2014).
- Gao, J., Wang, Y., Zhao, X., Chen, P., Xie, L. MicroRNA-204-5p-Mediated Regulation of SIRT1 Contributes to the Delay of Epithelial Cell Cycle Traversal in Diabetic Corneas. Invest Ophthalmol Vis Sci. 56 (3), 1493-1504 (2015).
- Koulikovska, M., et al. Enhanced regeneration of corneal tissue via a bioengineered collagen construct implanted by a nondisruptive surgical technique. Tissue Eng Part A. 21 (5-6), 1116-1130 (2015).
- Ljubimov, A. V., Saghizadeh, M. Progress in corneal wound healing. Progress in retinal and eye research. 49, 17-45 (2015).
- Zieske, J. D. Extracellular matrix and wound healing. Curr Opin Ophthalmol. 12 (4), 237-241 (2001).
- Karamichos, D., Hutcheon, A. E., Zieske, J. D. Transforming growth factor-beta3 regulates assembly of a non-fibrotic matrix in a 3D corneal model. J Tissue Eng Regen Med. 5 (8), e228-e238 (2011).
- Karamichos, D., Lakshman, N., Petroll, W. M. An experimental model for assessing fibroblast migration in 3-D collagen matrices. Cell Motil Cytoskeleton. 66 (1), 1-9 (2009).
- Karamichos, D., et al. Novel in Vitro Model for Keratoconus Disease. J Funct Biomater. 3 (4), 760-775 (2012).
