Hornhinnen Tissue Engineering: En In Vitro modell av Stromal-nerve samspillet av menneskelig hornhinnen
Summary
Denne protokollen beskriver en roman tredimensjonale i vitro modell, der hornhinnen stromal cellene og differensiert neuronal er kultivert sammen å bistå i eksamen og forståelse av samspillet av de to celletyper.
Abstract
Tissue engineering har fått betydelig anerkjennelse på grunn av den høye etterspørselen etter menneskelig hornhinnen erstatninger med anslagsvis 10 millioner mennesker over hele verden lider av hornhinnen visjonen tap1. For å møte etterspørselen etter levedyktig menneskelige hornhinner, betydelig fremgang i tredimensjonale (3D) vev har engineering gjort2,3,4. Disse hornhinnen modeller varierer fra enkel monolayer systemer flerlags modeller, fører til 3D full-tykkelse hornhinnen ekvivalenter2.
Men bruk av en 3D vev-konstruert hornhinnen i sammenheng med i vitro sykdom modeller studerte til dato mangler likhet med flerlags 3D hornhinnen tissue struktur, funksjon og nettverk i ulike celletyper (dvs., nerve, epitel stroma og endotelet)2,3. I tillegg økt har etterspørselen for i vitro hornhinnen tissue modeller i et forsøk på å redusere dyreforsøk for farmasøytiske produkter. Dermed mer avanserte modeller kreves passer bedre systemer til menneskets fysiologiske behov, og utvikling av en modell som er mer relevante for pasienten befolkningen er absolutt nødvendig. Gitt at flere celletyper i hornhinnen påvirkes av sykdommer og dystrophies, som keratokonus og diabetiker Keratopathy Fuchs, inkluderer denne modellen en 3D co kultur modell av primære menneskelig hornhinnen fibroblaster (HCFs) fra friske blodgivere og neurons fra SH-SY5Y celle linjen. Dette gjør oss for første gang å undersøke samspillet mellom de to celletyper i menneskelig hornhinnen tissue. Vi tror at denne modellen kunne potensielt dissekere de underliggende mekanismene tilknyttet stromal-nerve samhandling hornhinnen sykdommer som viser nerve skader. Denne 3D-modellen gjenspeiler anatomiske og fysiologiske natur for hornhinnen tissue vivo og kan brukes i fremtiden som et verktøy for undersøke hornhinnen defekter, samt screening effekten av ulike agenter før dyreforsøk.
Introduction
I menneskekroppen er hornhinnen tettest innervated vev. Nervene er ansvarlig for ulike opplevelser som touch, smerte, temperatur, og har også en viktig rolle i sårtilheling, blinker reflekser, rive produksjon og sekresjon5,6,7. I hornhinnen, stromal nerve badebukser oppstår fra den limbal plexus og angir det eksterne hornhinnen stroma radielt. Stromal nerve organisasjonen er parallelt med kollagen lamellae de videre forgrening til mindre fascicles når de fortsetter mot den overfladiske stroma5,8. Nervefibrene ytterligere trenge epiteliale lag og dermed gir er vidt spredt ut over hornhinnen epitel og stroma. Derfor har gir en viktig rolle i friske og syke delstaten hornhinnen. I denne protokollen avslører vi fremme en roman 3D i vitro modell, som er først av sitt slag å etterligne i vivo stromal-nerve interaksjoner. SH-SY5Y celle linjen ble brukt for denne studien, som det er en av de mest etablerte, vel preget linjene brukes til å studere dannes hemmer nevronal vekst. SH-SY5Y celle linjen har blitt beskrevet å produsere begge underlaget tilhenger (S-type) og neuroblastic (N-type) celler som kan gjennomgå transdifferentiation9. Som et resultat, selv om denne cellen linjen er avledet fra et tre påfølgende subclone utvalg av N-type celler, inneholder den også et lite antall S-type celler kan gjennomgår differensiering inn neurons gjennom bruk av retinoic acid og hjerne-avledet nevrotropisk faktor9. Dette gir et verktøy som kan føre til en bedre forståelse av hornhinnen komplikasjoner knyttet diabetisk retinopati (DM) og andre øyet sykdommer. På grunn av problemer knyttet til å skaffe og dyrking neurons fra pasienter med okulær sykdom, gir denne 3D i vitro modellen betydelig implikasjonene i studere neuronal samspillet og signalnettverk med det hornhinnen stroma.
Syke forhold påvirker ofte ulike vev i kroppen på en stor skala, fører til en kompromittert livskvalitet. Okulære dystrophies er vanlige komplikasjoner ofte assosiert med systemiske sykdommer og føre til tap av synsskarphet eller selv permanent synstap. Omfattende studier er ofte avgjørende for en bedre forståelse av betingelsen sykdom som effekter på basale cellenivå. For å studere virkningene av slike sykdommer, har ulike i vivo og i vitro modeller blitt utviklet ved hjelp av vev utvikling programmer. Hornhinnen tissue engineering programmer har fått stor interesse i ulike felt av vitenskap,10,,11,,12,,13,,14, men det er fortsatt store begrensninger under selve programmet, inkludert hornhinnen pode avvisning, infeksjoner og arrdannelse10,11,12,13,14. Det er flere studier som har utviklet og etablert ulike i vitro modeller3,15,16,17,18, 19,20,21,22,23,24,25,26. 3D i vitro modellene er de mest lovende og av stor vitenskapelig interesse. 3D-modeller er kjent for å bedre speil i vivo mobilnettet og fysiologiske hendelsene som er kritiske under fibrose og sår helbredelse15,27,28,29. Modellene i vitro spiller en integrert rolle i å finne nye behandlingsmetoder for behandling av ulike sykdom betingelser inkludert hornhinnen komplikasjoner. Til tross for den kritiske rollen gir i hornhinnen funksjoner, har liten innsats blitt gjort å fremme perifere nerve spredning i hornhinnen tissue-konstruert konstruksjoner2,3. Imidlertid etterligne de foreslåtte 3D i vitro celle konstruksjoner vevet for å oppnå ønsket vev funksjonaliteten.
Diabetiker keratopathy er et opplagt program for modellen beskrevet her på grunn av neuronal defekter, finnes det flere andre hornhinnen sykdommer som kan ha nytte menneskelig i vitro modell inkludert Keratoconus og Fuchs dystrophies. Våre 3D-modellen kommer fra dette prospektet og foreslår utviklingen av en i vitro representasjon av hornhinnen tissue å vurdere narkotika-leveranser og nye okulær medisiner.
Protocol
Representative Results
Discussion
Flere studier har vært fokusert på å utvikle ulike dyr modeller som kan bidra til å utvikle en bedre forståelse av hornhinnen sykdommer samt oppdage behandlinger. Imidlertid er en betydelig verdi til mennesker fra disse studiene ikke bekreftet. Hittil har er ulike i vitro modeller utviklet og mye undersøkt på grunn av deres bemerkelsesverdige klinisk betydning. Vår tidligere etablert 3D i vitro modell er en roman system som betydelig bidrar til medisinsk vitenskap fremskritt i visjon forskning o…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi ønsker å utvide vår oppriktige takk til Dr. Ben Fowler for hans teknisk hjelp med TEM eksperimenter.
Materials
| Healthy corneal tissue | NDRI | Samples from donors with no ocular trauma or systemic disease | |
| Dulbecco’s Phosphate Buffered Solution (1X) | Gibco by Life Technologies | 14190-144 | |
| Sterile forceps | Fischer Scientific | 13-812-42 | Fisherbrand Dissecting Extra-Fine-Pointed Splinter Forceps |
| Single edge razor blades | Personna | 270100 | |
| Sterile surgical scalpel blades No.10 | Feather Surgical Blade | 2976#10 | |
| Eagle’s Minimum Essential Medium | ATCC | 30-2003 | |
| Fetal Bovine Serum | Atlanta Biologicals | S11550 | 10% FBS is required for media preparation |
| Antibiotic-Antimycotic (100X) | Gibco by Life Technologies | 15240-062 | 1% Antibiotic-Antimycotic is required for media preparation |
| 0.05% Trypsin EDTA(1X) | Gibco by Life Technologies | 25300062 | |
| Polycarbonate membrane inserts with 0.4-μm pores | Corning Costar | 3412 | |
| 2-O-α-Dglucopyranosyl-L-ascorbic acid (Vitamin C) | Sigma-Aldrich | SMB00390-14 | A concentration of 0.5 mM should be used for the study |
| Wax block | VWR | 50-949-027 | |
| SH-SY5Y Neuroblastoma cells | ATCC | SHSY5YATCC CRL-2266 | |
| Retinoic Acid | Sigma-Aldrich | SRP3014-10UG | Final concentration of 10uM needs to be used |
| BDNF | Sigma-Aldrich | R2625-100MG | Final concentration of 2nM needs to be used |
| Dimethyl Sulfoxide(DMSO) | VWR-Alfa Aesar | 67-68-5 | Ultra Pure Grade-Sterile DMSO to be used |
| Thermo Scientific Nunc Cell Culture Treated EasYFlasks (T25) | Fisher Scientific | 12-565-351 | |
| Thermo Scientific Nunc Cell Culture Treated EasYFlasks (T75) | Fisher Scientific | 12-565-349 |
Referências
- Pascolini, D., Mariotti, S. P. Global estimates of visual impairment: 2010. Br J Ophthalmol. 96 (5), 614-618 (2012).
- Rönkkö, S., Vellonen, K. -. S., Järvinen, K., Toropainen, E., Urtti, A. Human corneal cell culture models for drug toxicity studies. Drug Delivery and Translational Research. 6 (6), 660-675 (2016).
- Ghezzi, C. E., Rnjak-Kovacina, J., Kaplan, D. L. Corneal tissue engineering: recent advances and future perspectives. Tissue Eng Part B Rev. 21 (3), 278-287 (2015).
- Shafaie, S., Hutter, V., Cook, M. T., Brown, M. B., Chau, D. Y. S. In Vitro Cell Models for Ophthalmic Drug Development Applications. BioResearch Open Access. 5 (1), 94-108 (2016).
- Shaheen, B. S., Bakir, M., Jain, S. Corneal nerves in health and disease. Surv Ophthalmol. 59 (3), 263-285 (2014).
- Beuerman, R. W., Schimmelpfennig, B. Sensory denervation of the rabbit cornea affects epithelial properties. Exp Neurol. 69 (1), 196-201 (1980).
- Heigle, T. J., Pflugfelder, S. C. Aqueous tear production in patients with neurotrophic keratitis. Cornea. 15 (2), 135-138 (1996).
- Wang, S., et al. In vitro 3D corneal tissue model with epithelium, stroma, and innervation. Biomaterials. 112, 1-9 (2017).
- Ross, R. A., Spengler, B. A., Biedler, J. L. Coordinate morphological and biochemical interconversion of human neuroblastoma cells. J Natl Cancer Inst. 71 (4), 741-747 (1983).
- Griffith, L. G., Naughton, G. Tissue engineering – Current challenges and expanding opportunities. Science. 295 (5557), (2002).
- Guo, X., et al. Morphologic characterization of organized extracellular matrix deposition by ascorbic acid-stimulated human corneal fibroblasts. Invest Ophthalmol Vis Sci. 48 (9), 4050-4060 (2007).
- Karamichos, D. Ocular tissue engineering: current and future directions. J Funct Biomater. 6 (1), 77-80 (2015).
- Karamichos, D., Brown, R. A., Mudera, V. Collagen stiffness regulates cellular contraction and matrix remodeling gene expression. J Biomed Mater Res A. 83 (3), 887-894 (2007).
- Ruberti, J. W., Zieske, J. D. Prelude to corneal tissue engineering – gaining control of collagen organization. Prog Retin Eye Res. 27 (5), 549-577 (2008).
- Karamichos, D., Guo, X. Q., Hutcheon, A. E., Zieske, J. D. Human corneal fibrosis: an in vitro model. Invest Ophthalmol Vis Sci. 51 (3), 1382-1388 (2010).
- Chen, F. M., Liu, X. Advancing biomaterials of human origin for tissue engineering. Prog Polym Sci. 53, 86-168 (2016).
- Priyadarsini, S., Sarker-Nag, A., Rowsey, T. G., Ma, J. X., Karamichos, D. Establishment of a 3D In Vitro Model to Accelerate the Development of Human Therapies against Corneal Diabetes. PLoS One. 11 (12), e0168845 (2016).
- Karamichos, D., Hjortdal, J. Keratoconus: tissue engineering and biomaterials. J Funct Biomater. 5 (3), 111-134 (2014).
- Wilson, S. L., Yang, Y., El Haj, A. J. Corneal Stromal Cell Plasticity: In Vitro Regulation of Cell Phenotype Through Cell-Cell Interactions in a Three-Dimensional Model. Tissue Engineering Part A. 20 (1-2), 225-238 (2014).
- Proulx, S., et al. Reconstruction of a human cornea by the self-assembly approach of tissue engineering using the three native cell types. Molecular Vision. 16 (234-236), 2192-2201 (2010).
- Gonzalez-Andrades, M., et al. Establishment of a novel in vitro model of stratified epithelial wound healing with barrier function. Sci Rep. 6, 19395 (2016).
- Hopkins, A. M., DeSimone, E., Chwalek, K., Kaplan, D. L. 3D in vitro modeling of the central nervous system. Prog Neurobiol. 125, 1-25 (2015).
- Schulz, S., et al. Natural Corneal Cell-Based Microenvironment as Prerequisite for Balanced 3D Corneal Epithelial Morphogenesis: A Promising Animal Experiment-Abandoning Tool in Ophthalmology. Tissue Engineering Part C-Methods. 20 (4), 297-307 (2014).
- Gao, J., Wang, Y., Zhao, X., Chen, P., Xie, L. MicroRNA-204-5p-Mediated Regulation of SIRT1 Contributes to the Delay of Epithelial Cell Cycle Traversal in Diabetic Corneas. Invest Ophthalmol Vis Sci. 56 (3), 1493-1504 (2015).
- Koulikovska, M., et al. Enhanced regeneration of corneal tissue via a bioengineered collagen construct implanted by a nondisruptive surgical technique. Tissue Eng Part A. 21 (5-6), 1116-1130 (2015).
- Ljubimov, A. V., Saghizadeh, M. Progress in corneal wound healing. Progress in retinal and eye research. 49, 17-45 (2015).
- Zieske, J. D. Extracellular matrix and wound healing. Curr Opin Ophthalmol. 12 (4), 237-241 (2001).
- Karamichos, D., Hutcheon, A. E., Zieske, J. D. Transforming growth factor-beta3 regulates assembly of a non-fibrotic matrix in a 3D corneal model. J Tissue Eng Regen Med. 5 (8), e228-e238 (2011).
- Karamichos, D., Lakshman, N., Petroll, W. M. An experimental model for assessing fibroblast migration in 3-D collagen matrices. Cell Motil Cytoskeleton. 66 (1), 1-9 (2009).
- Karamichos, D., et al. Novel in Vitro Model for Keratoconus Disease. J Funct Biomater. 3 (4), 760-775 (2012).
