Ingegneria tissutale corneale: Un In Vitro modello delle interazioni Stromal-nervo della Cornea umana
Summary
Questo protocollo descrive un romanzo tridimensionale in vitro modello, cui sono coltivate cellule stromal corneale e cellule neuronali differenziate insieme per assistere nell’esame e nella comprensione delle interazioni tra i due tipi cellulari.
Abstract
Ingegneria tissutale ha guadagnato riconoscimento sostanza a causa della forte domanda per le sostituzioni di cornea umana con circa 10 milioni di persone in tutto il mondo soffrono di perdita di visione corneale1. Per rispondere alla domanda di cornee umane vitali, progressi significativi nel tessuto di tridimensionale (3D) ingegneria è stato fatto2,3,4. Questi gamma di modelli di cornea da sistemi monostrato semplice ai modelli multilivello, che conduce a 3D equivalenti corneale di pieno-spessore2.
Tuttavia, l’uso di una cornea tessutale 3D nel contesto dei modelli di malattia in vitro studiato per data non ha somiglianza con la struttura multistrato 3D tessuto corneale, funzione e la messa in rete di diversi tipi di cellule (cioè, nervo, epitelio, stroma ed endotelio)2,3. Inoltre, la domanda per i modelli di tessuti in vitro cornea è aumentata nel tentativo di ridurre la sperimentazione animale per i prodotti farmaceutici. Così, modelli più sofisticati sono tenuti a corrispondere meglio sistemi ai requisiti fisiologici umani e lo sviluppo di un modello che è più rilevante per la popolazione di pazienti è assolutamente necessario. Dato che più tipi di cellule nella cornea sono colpiti da malattie e distrofie, quali cheratocono, cheratopatia diabetica e Fuchs, questo modello include un modello 3D co-coltura di fibroblasti corneali umani primari (HCF) da donatori sani e neuroni da la linea di cellule SH-SY5Y. Questo ci permette per la prima volta studiare le interazioni tra i due tipi cellulari all’interno del tessuto cornea umano. Crediamo che questo modello potrebbe potenzialmente sezionare i meccanismi di fondo connessi con le interazioni di stromal-nervo di patologie corneali che presentano danni del nervo. Questo modello 3D rispecchia la natura di base anatomica e fisiologica del tessuto corneale in vivo e utilizzabile in futuro come uno strumento per indagare i difetti corneali così come l’efficacia di vari agenti di screening prima sperimentazione animale.
Introduction
Nel corpo umano, la cornea è il tessuto più densamente innervato. I nervi sono responsabili di varie sensazioni come touch, dolore, temperatura e hanno anche un ruolo essenziale nella guarigione delle ferite, lampeggiano i riflessi, tear produzione e secrezione5,6,7. Nella cornea, tronchi del nervo stromal derivano dal plesso limbal e immettere lo stroma cornea periferico radialmente. L’organizzazione di stromal del nervo è parallelo le lamelle collagene e ulteriore diramazione in fasci più piccoli come si procede verso il stroma superficiale5,8. Le fibre nervose ulteriormente penetrare lo strato epiteliale e così, lo stimolo è ampiamente sparso attraverso l’epitelio corneale e lo stroma. Di conseguenza, lo stimolo ha un ruolo essenziale nello stato sano e malato della cornea. In questo protocollo, riveliamo l’avanzamento di un modello di romanzo 3D in vitro , che è il primo del suo genere per simulare le interazioni di stromal-nervo in vivo . La linea di cellule SH-SY5Y era utilizzata per questo studio, in quanto è una delle linee più affermate, ben caratterizzate utilizzate per studiare la crescita neuronale. La linea di cellule SH-SY5Y è stato descritta per produrre sia aderente di substrato (S-type) e neuroblastic (tipo N) che le cellule possono subire transdifferenziazione9. Di conseguenza, anche se questa linea cellulare è derivata da una selezione di triple consecutive subclone di cellule di tipo N, che contiene anche un piccolo numero di cellule di tipo S in grado di subire il differenziamento in neuroni attraverso l’uso di retinoico acido e cervello-derivato neurotrophic factor9. Questo fornisce uno strumento che può portare a una migliore comprensione delle complicazioni corneale connesse con retinopatia diabetica (DM) e altre malattie oculari. A causa di difficoltà associate all’ottenimento e coltura neuroni da pazienti con malattia oculare, questo modello 3D in vitro fornisce notevoli implicazioni nello studio delle interazioni neuronali e segnalazione con lo stroma corneale.
Circostanze malate spesso colpiscono vari tessuti del corpo ad una scala molto grande, che porta ad una qualità della vita compromessa. Le distrofie oculare sono complicazioni comuni spesso associate a malattie sistemiche e portare alla perdita dell’acuità visiva o anche permanente della vista. Studi completi sono spesso essenziali per una migliore comprensione della condizione di malattia, come pure gli effetti a livello cellulare basale. Per studiare gli effetti di tali malattie, sono stati sviluppati vari modelli in vivo e in vitro con l’aiuto di applicazioni di ingegneria tissutale. Applicazioni di ingegneria del tessuto corneale hanno raccolto grande interesse in vari settori della scienza10,11,12,13,14, ma ci sono ancora notevoli limitazioni durante effettiva applicazione, tra cui corneale dell’innesto respingimenti, infezioni e cicatrici10,11,12,13,14. Ci sono diversi studi che hanno sviluppato con successo e stabilite varie in vitro modelli3,15,16,17,18, 19,20,21,22,23,24,25,26. I modelli 3D in vitro sono i più promettenti e di grande interesse scientifico. Modelli 3D sono noti per meglio rispecchiare il in vivo eventi cellulari e fisiologiche che sono critici durante la fibrosi e ferita guarigione15,27,28,29. Questi modelli in vitro giocano un ruolo fondamentale nella ricerca di nuovi approcci terapeutici per il trattamento di diverse patologie tra cui le complicazioni corneali. Nonostante il ruolo critico dell’innervazione nelle funzioni corneale, piccoli sforzi compiuti per promuovere la proliferazione di nervo periferico all’interno di costrutti tessutale corneale2,3. Tuttavia, i costrutti di cella proposto 3D in vitro imitano il tessuto bersaglio al fine di conseguire la funzionalità del tessuto desiderato.
Mentre keratopathy diabetica è un’applicazione evidente per il modello descritto qui dovuto i difetti di un neurone, ci sono parecchie altre malattie corneali che possono beneficiare di un modello umano in vitro compreso le distrofie cheratocono e Fuchs. Il nostro modello 3D emerge da questa prospettiva e propone lo sviluppo di una rappresentazione in vitro del tessuto corneale per valutare la somministrazione di farmaci e la sicurezza dei nuovi farmaci oculari.
Protocol
Representative Results
Discussion
Diversi studi si sono concentrati sullo sviluppo di vari modelli animali che possono aiutare a sviluppare una migliore comprensione delle malattie della cornea così come scoprire i trattamenti. Tuttavia, un notevole valore agli esseri umani da questi studi non è stato verificato. Ad oggi, vari modelli in vitro sono sviluppati e ampiamente studiati a causa della loro notevole importanza clinica. Il nostro modello precedentemente stabilito 3D in vitro è un innovativo sistema significativamente contribu…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vorremmo estendere il nostro sincero grazie a Dr. Ben Fowler per il suo aiuto tecnico con gli esperimenti TEM.
Materials
| Healthy corneal tissue | NDRI | Samples from donors with no ocular trauma or systemic disease | |
| Dulbecco’s Phosphate Buffered Solution (1X) | Gibco by Life Technologies | 14190-144 | |
| Sterile forceps | Fischer Scientific | 13-812-42 | Fisherbrand Dissecting Extra-Fine-Pointed Splinter Forceps |
| Single edge razor blades | Personna | 270100 | |
| Sterile surgical scalpel blades No.10 | Feather Surgical Blade | 2976#10 | |
| Eagle’s Minimum Essential Medium | ATCC | 30-2003 | |
| Fetal Bovine Serum | Atlanta Biologicals | S11550 | 10% FBS is required for media preparation |
| Antibiotic-Antimycotic (100X) | Gibco by Life Technologies | 15240-062 | 1% Antibiotic-Antimycotic is required for media preparation |
| 0.05% Trypsin EDTA(1X) | Gibco by Life Technologies | 25300062 | |
| Polycarbonate membrane inserts with 0.4-μm pores | Corning Costar | 3412 | |
| 2-O-α-Dglucopyranosyl-L-ascorbic acid (Vitamin C) | Sigma-Aldrich | SMB00390-14 | A concentration of 0.5 mM should be used for the study |
| Wax block | VWR | 50-949-027 | |
| SH-SY5Y Neuroblastoma cells | ATCC | SHSY5YATCC CRL-2266 | |
| Retinoic Acid | Sigma-Aldrich | SRP3014-10UG | Final concentration of 10uM needs to be used |
| BDNF | Sigma-Aldrich | R2625-100MG | Final concentration of 2nM needs to be used |
| Dimethyl Sulfoxide(DMSO) | VWR-Alfa Aesar | 67-68-5 | Ultra Pure Grade-Sterile DMSO to be used |
| Thermo Scientific Nunc Cell Culture Treated EasYFlasks (T25) | Fisher Scientific | 12-565-351 | |
| Thermo Scientific Nunc Cell Culture Treated EasYFlasks (T75) | Fisher Scientific | 12-565-349 |
Referências
- Pascolini, D., Mariotti, S. P. Global estimates of visual impairment: 2010. Br J Ophthalmol. 96 (5), 614-618 (2012).
- Rönkkö, S., Vellonen, K. -. S., Järvinen, K., Toropainen, E., Urtti, A. Human corneal cell culture models for drug toxicity studies. Drug Delivery and Translational Research. 6 (6), 660-675 (2016).
- Ghezzi, C. E., Rnjak-Kovacina, J., Kaplan, D. L. Corneal tissue engineering: recent advances and future perspectives. Tissue Eng Part B Rev. 21 (3), 278-287 (2015).
- Shafaie, S., Hutter, V., Cook, M. T., Brown, M. B., Chau, D. Y. S. In Vitro Cell Models for Ophthalmic Drug Development Applications. BioResearch Open Access. 5 (1), 94-108 (2016).
- Shaheen, B. S., Bakir, M., Jain, S. Corneal nerves in health and disease. Surv Ophthalmol. 59 (3), 263-285 (2014).
- Beuerman, R. W., Schimmelpfennig, B. Sensory denervation of the rabbit cornea affects epithelial properties. Exp Neurol. 69 (1), 196-201 (1980).
- Heigle, T. J., Pflugfelder, S. C. Aqueous tear production in patients with neurotrophic keratitis. Cornea. 15 (2), 135-138 (1996).
- Wang, S., et al. In vitro 3D corneal tissue model with epithelium, stroma, and innervation. Biomaterials. 112, 1-9 (2017).
- Ross, R. A., Spengler, B. A., Biedler, J. L. Coordinate morphological and biochemical interconversion of human neuroblastoma cells. J Natl Cancer Inst. 71 (4), 741-747 (1983).
- Griffith, L. G., Naughton, G. Tissue engineering – Current challenges and expanding opportunities. Science. 295 (5557), (2002).
- Guo, X., et al. Morphologic characterization of organized extracellular matrix deposition by ascorbic acid-stimulated human corneal fibroblasts. Invest Ophthalmol Vis Sci. 48 (9), 4050-4060 (2007).
- Karamichos, D. Ocular tissue engineering: current and future directions. J Funct Biomater. 6 (1), 77-80 (2015).
- Karamichos, D., Brown, R. A., Mudera, V. Collagen stiffness regulates cellular contraction and matrix remodeling gene expression. J Biomed Mater Res A. 83 (3), 887-894 (2007).
- Ruberti, J. W., Zieske, J. D. Prelude to corneal tissue engineering – gaining control of collagen organization. Prog Retin Eye Res. 27 (5), 549-577 (2008).
- Karamichos, D., Guo, X. Q., Hutcheon, A. E., Zieske, J. D. Human corneal fibrosis: an in vitro model. Invest Ophthalmol Vis Sci. 51 (3), 1382-1388 (2010).
- Chen, F. M., Liu, X. Advancing biomaterials of human origin for tissue engineering. Prog Polym Sci. 53, 86-168 (2016).
- Priyadarsini, S., Sarker-Nag, A., Rowsey, T. G., Ma, J. X., Karamichos, D. Establishment of a 3D In Vitro Model to Accelerate the Development of Human Therapies against Corneal Diabetes. PLoS One. 11 (12), e0168845 (2016).
- Karamichos, D., Hjortdal, J. Keratoconus: tissue engineering and biomaterials. J Funct Biomater. 5 (3), 111-134 (2014).
- Wilson, S. L., Yang, Y., El Haj, A. J. Corneal Stromal Cell Plasticity: In Vitro Regulation of Cell Phenotype Through Cell-Cell Interactions in a Three-Dimensional Model. Tissue Engineering Part A. 20 (1-2), 225-238 (2014).
- Proulx, S., et al. Reconstruction of a human cornea by the self-assembly approach of tissue engineering using the three native cell types. Molecular Vision. 16 (234-236), 2192-2201 (2010).
- Gonzalez-Andrades, M., et al. Establishment of a novel in vitro model of stratified epithelial wound healing with barrier function. Sci Rep. 6, 19395 (2016).
- Hopkins, A. M., DeSimone, E., Chwalek, K., Kaplan, D. L. 3D in vitro modeling of the central nervous system. Prog Neurobiol. 125, 1-25 (2015).
- Schulz, S., et al. Natural Corneal Cell-Based Microenvironment as Prerequisite for Balanced 3D Corneal Epithelial Morphogenesis: A Promising Animal Experiment-Abandoning Tool in Ophthalmology. Tissue Engineering Part C-Methods. 20 (4), 297-307 (2014).
- Gao, J., Wang, Y., Zhao, X., Chen, P., Xie, L. MicroRNA-204-5p-Mediated Regulation of SIRT1 Contributes to the Delay of Epithelial Cell Cycle Traversal in Diabetic Corneas. Invest Ophthalmol Vis Sci. 56 (3), 1493-1504 (2015).
- Koulikovska, M., et al. Enhanced regeneration of corneal tissue via a bioengineered collagen construct implanted by a nondisruptive surgical technique. Tissue Eng Part A. 21 (5-6), 1116-1130 (2015).
- Ljubimov, A. V., Saghizadeh, M. Progress in corneal wound healing. Progress in retinal and eye research. 49, 17-45 (2015).
- Zieske, J. D. Extracellular matrix and wound healing. Curr Opin Ophthalmol. 12 (4), 237-241 (2001).
- Karamichos, D., Hutcheon, A. E., Zieske, J. D. Transforming growth factor-beta3 regulates assembly of a non-fibrotic matrix in a 3D corneal model. J Tissue Eng Regen Med. 5 (8), e228-e238 (2011).
- Karamichos, D., Lakshman, N., Petroll, W. M. An experimental model for assessing fibroblast migration in 3-D collagen matrices. Cell Motil Cytoskeleton. 66 (1), 1-9 (2009).
- Karamichos, D., et al. Novel in Vitro Model for Keratoconus Disease. J Funct Biomater. 3 (4), 760-775 (2012).
