Metoder for Imaging intracellulær pH i hårsekken stamcelleforskningen slektslinje i Live Drosophila Ovarian vev

Summary

Vi tilbyr en protokoll for imaging intracellulær pH i en epithelial stamcelleforskningen slektslinje i levende Drosophila ovarian vev. Vi beskriver metoder for å generere transgene fluer uttrykke en pH biosensor, mCherry::pHluorin, bilde biosensor med kvantitative fluorescens imaging, standard kurver genererer og konvertere fluorescens intensitetsverdiene til pH-verdier.

Abstract

Endringer i intracellulær pH (pHi) spille en viktig rolle i regulering av mange cellulære funksjoner, inkludert metabolisme, spredning og differensiering. Vanligvis bestemmes pHi dynamikken i kulturperler celler som er mottagelig for å måle og manipulere eksperimentelt pHi. Men har den siste utviklingen av nye verktøy og metoder gjort det mulig å studere pHi dynamikken i intakt, levende vev. For Drosophila forskning, en viktig utvikling var generasjonen av transgene linjen bærer en pHi biosensor, mCherry::pHluorin. Her beskriver vi en protokoll som vi rutinemessig bruker for bildebehandling live Drosophila ovarioles å måle pHi i epithelial hårsekken stilk cellen (FSC) avstamning i mCherry::pHluorin transgene vill-type linjer; men kan metodene som er beskrevet her enkelt tilpasses for andre vev, inkludert fløyen plater og øye epitel. Vi beskriver teknikker for å uttrykke mCherry::pHluorin i FSC avstamning, opprettholde ovarian vev under live bildebehandling, og anskaffe og analysere bilder for å få pHi verdier.

Introduction

Nyere studier viste en rolle for endringer i pHi under cellulære differensiering og dysplasia vivo^1,,². Disse studiene fant at pHi er bemerkelsesverdig konsekvent i celler av samme type på samme scene differensiering, men at den endres mens celler overgangen fra ett stadium til et annet. I noen tilfeller forstyrrer blokkerer endringene i pHi delvis differensiering, antyder at endringen i pHi er ikke bare en konsekvens av endringer i celle skjebne, men i stedet bidrar til å fremme endring i cellen skjebne, kanskje gjennom effekter på pH-sensitive regulatoriske proteiner eller kjemiske reaksjoner kreves for differensiering. Fremtidige studier har potensial til å avsløre mer innsikt i de mange forskjellige rollene av pHi dynamikken i vivo. Imidlertid er en av utfordringene med å studere pHi under differensiering i vivo å få nøyaktige målinger av pHi. I motsetning til andre funksjoner av differensiering, for eksempel endringer i mobilnettet morfologi og genuttrykk, er pHi en labil kjemiske egenskaper av cellen som ikke beholdes i celler som er fast og permeabilized med standard metoder. I tillegg kan pHi ikke være stabil i celler som er stresset eller døende som følge av eksperimentelle manipulasjon. Derfor er det viktig å holde cellene i live og så frisk som mulig når du måler pHi. Flere viktige fargestoffer er tilgjengelig som fungerer bra for måling pHi celler i kultur³, men i mange tilfeller de ikke er egnet for i vivo studier fordi de ikke trenge gjennom vevet dypt eller jevnt nok til å gi presise målinger .

For å omgå problemet med dårlig fargestoff penetrasjon, har vi og andre brukt en genetisk kodet sonde, mCherry::pHluorin^4,5,6,7, som kan uttrykkes i cellen typer av interesse og fotografert i levende vev. pHluorin er en variant av GFP med en høyere pKa (~ 7.0 vs. ~ 4.0) som kaster mer lett på høyere pH; så total fluorescens intensiteten slippes ut fra en befolkning på pHluorin molekylene i cellen øker med økende pHi⁸. Viktigere er fluorescens lineær innenfor normalområdet cytosolic pHi verdier. I kontrast, fluorescens av mCherry (pKa ~ 4.5) er bokstaver pH endringer innen cytosolic. Disse to journalister kobles covalently sammen i en enkelt chimeric protein, kodet av en åpen leseramme, så de er alltid til stede i like mengder. Forholdet mellom pHluorin til mCherry fluorescens intensitet gir derfor en måling av pHi som er normalisert til sonde konsentrasjonen i hver celle. Forholdstallene kan deretter konverteres til anslag over pHi verdier ved hjelp av en standard kurven som genereres ved å få tak i pHluorin til mCherry prosenter fra vev som har vært equilibrated kjent pH-verdier.

Her beskriver vi metodene for å bruke mCherry::pHluorin til å måle pHi av epitelial FSC slektslinje i Drosophila eggstokken. Dette godt karakterisert vevet er brukt til å modellere mange ulike aspekter av epitelial biologi, for eksempel stamcelleforskningen selvtillit fornyelse og differensiering^9,10,11, kollektive celle migrasjon¹² , samt utvikling og vedlikehold av cellen polaritet^13,14. Hårsekken epitel er produsert av to FSCs som befinner seg på fremre kant av vevet i en struktur som kalles germarium^15,16. Disse cellene dele regelmessig voksen selvstendig fornye og produsere avkom, kalt prefollicle celler (PFK), som kan skrive inn nisje og bli en FSC eller skille ut en av tre forskjellige hårsekken celletyper: polar celler, stilk celler, eller hoveddelen hårsekken celler. Vi viste tidligere at i wildtype vev, pHi øker jevnt i de tidlige stadiene av differensiering, fra en pHi av ca 6.8 i FSCs 7.0 i pFCs, til 7.3 i hårsekken celler². Blokkerer denne økningen av RNAi knockdown av en overalt uttrykt natrium/proton exchanger, DNhe2, alvorlig svekker pFC differensiering, mens øke pHi ved overuttrykte DNhe2 forårsaker en mild overflødig differensiering fenotypen. Disse funnene viser at pHi opprettholdes stabilt i tidlig FSC avstamning og at det kan være eksperimentelt økt eller redusert i vivo. Metodene som er beskrevet her kan brukes til å måle pHi i wildtype vev eller ulike former for mutant vev, inkludert RNAi knockdown eller overuttrykte med en Gal4 av interesse, og mitotisk kloner.

Protocol

Merk: for å måle pHi i FSC avstamning, vi beregne forholdet mellom fluorescens intensiteter av pHluorin til mCherry i FSCs og pFCs hårsekken celler i fysiologiske forhold, og konvertere forholdstallene i pHi verdier med standard kalibrering kurver for hver celle type 7. Første, live bildebehandling eksperimenter utføres for å måle fluorescens intensiteter av pHluorin og mCherry i germaria deles opp i en buffer som inneholder NaHCO 3, som etterligner fysiologiske forhold <sup cl…

Representative Results

Her har vi beskrevet prosessen å måle pHi i hårsekken epitel, som omfatter flere trinn. Først er eggstokkene dissekert fra flyr av aktuelle genotype bruker verktøy for dissekere og montering (figur 1). Ovarioles er da fotografert med kvantitative fluorescens mikroskopi og bildene analyseres for å få målinger av pHi. For hvert bilde identifiseres i celletyper interessepunkter som beskrevet i delen 3.1 (figur 2). Forholdet …

Discussion

Her beskriver vi en metode for å måle pHi celler i FSC avstamning innen wildtype vev. Denne protokollen er utviklet og raffinert de siste fem årene, siden vi først begynte å studere pHi i Drosophila ovarian vev. Under oppstarten har protokollen vært brukt med hell av flere etterforskere i vår lab og på minst fire forskjellige spinning plate og laserskanning mikroskop. Reproduserbarhet vår opprinnelige observasjon, at pHi øker som celler i FSC avstamning skille fra stilk cellen til pFC til hårsekken ce…

Materials

Fly Stocks
UAS-mCherry::pHluorin[1]
y1 w*;P{GawB}10930/CyO	Bloomington Stock Center	7023
Act-Gal4 flipout stock	Bloomington Stock Center	4409
Name	Company	Catalog Number	Comments
Chemicals for Buffer preparation
NaCl	Sigma Aldrich	S5886
KCl	Sigma Aldrich	P-3911
glucose	Mallinckrodt	4912
HEPES	Thermo Fisher Scientific	BP310
MgSO4	Thermo Fisher Scientific	M63
CaCl2	Sigma Aldrich	C-5080
HCO3	Sigma Aldrich	S-5761
MgCl2	Sigma Aldrich	M-9272
NMDG+	Sigma Aldrich	M-2004
K2HPO4	Mallinckrodt	7088	Use to Make KHPO4 pH 7.4
KH2PO4	Thermo Fisher Scientific	BP362	Use to Make KHPO4 pH 7.4
Concanavalin A, Alexa Fluor 647 Conjugate	Thermo Fisher Scientific	C21421	0.25 mg/ml dilution
Nigericin	Thermo Fisher Scientific	N1495
Name	Company	Catalog Number	Comments
Dissection and mounting tools
2 Dumont Inox forceps (Size 5)	Thermo Fisher Scientific	NC9473431
2 23-gauge syringe needles	Sigma Aldrich	Z192457
9-well glass dissecting dish	Thermo Fisher Scientific	13-748B
Vacuum Grease	Dow Corning	1018817
22 X 40 mM glass coverslips	Thermo Fisher Scientific	12545C
Round Glass Coverslips, 12mm diameter, 0.13-0.16mm thickness	Ted Pella, Inc.	26023
3-D mounting chamber	custom manufactured		.stl and .ipt files for 3-D printer included as supplemental files
Name	Company	Catalog Number	Comments
Other equipment
pH meter	Thermo Fisher Scientific	13-620-183A	Model: Accumet AB15
Dissection microscope	Olympus Corporation	0H11436	Model: SZ2-ST
Confocal Microscope	Leica Biosystems		SP5 or SP8 laser-scanning confocal microscope with a 40× objective with a numerical aperture of 1.3