Vi tillhandahåller ett protokoll för imaging intracellulära pH i en epitelial stamceller härstamning i levande Drosophila äggstocksvävnad. Vi beskriva metoder för att generera transgena flugor uttrycker en pH biosensor, mCherry::pHluorin, bild den biosensor med hjälp av kvantitativa fluorescens imaging, generera standard kurvor och konvertera fluorescens intensitetsvärden till pH-värden.
Förändringar i intracellulära pH (pHi) spelar viktiga roller i regleringen av många cellulära funktioner, inklusive metabolism, proliferation och differentiering. Vanligtvis bestäms pHi dynamics i odlade celler, som kan bli föremål för mätning och experimentellt manipulera pHi. Men har den senaste utvecklingen av nya verktyg och metoder gjort det möjligt att studera pHi dynamiken inom intakt, levande vävnad. Drosophila forskning, var en viktig utveckling generationen av en transgen linje som bära en pHi biosensor, mCherry::pHluorin. Här beskriver vi ett protokoll som använder vi rutinmässigt för imaging levande Drosophila ovarioles att mäta pHi i epitelial follikeln stamceller (FSC) härstamning i mCherry::pHluorin transgena vildtyp linjer; dock kan de metoder som beskrivs här enkelt anpassas för andra vävnader, inklusive wing skivor och ögat epitel. Vi beskriver tekniker för att uttrycka mCherry::pHluorin i FSC härstamning, att upprätthålla äggstocksvävnad under levande imaging, och förvärva och analysera bilder för att få pHi värden.
Senare studier visade en roll för förändringar i pHi under cellulär differentiering och dysplasi i vivo1,2. Dessa studier fann att pHi är anmärkningsvärt konsekvent i celler av samma typ i samma skede av differentiering, men att det ändras när celler övergång från ett stadium till ett annat. I vissa fall stör blockerar ändringarna i pHi delvis differentiering, vilket tyder på att förändringen i pHi är inte bara en följd av förändringar i cell öde men istället bidrar till att främja förändringar i cell öde, kanske genom effekter på pH-känsliga rättsliga proteiner eller kemiska reaktioner krävs för differentiering. Framtida studier har potential att avslöja mer inblick i många olika roller pHi dynamics in-vivo. Dock är en av utmaningarna som studerar pHi under differentiering i vivo att erhålla noggranna mätningar av pHi. Till skillnad från andra funktioner av differentiering, såsom förändringar i cellulära morfologi och genuttryck, är pHi en labil kemisk egenskap av cellen som inte bevaras i celler som har fasta och permeabilized med standardmetoder. Dessutom kanske inte pHi stabil i celler som är stressade eller döende experimentella manipulering. Därför är det viktigt att hålla cellerna lever och så frisk som möjligt när man mäter pHi. Det finns flera avgörande färgämnen att fungerar bra för mätning av pHi av celler i kultur3, men i många fall de inte är lämpliga för i vivo studier eftersom de inte tränga vävnad djupt eller jämnt nog att ge noggranna mätningar .
För att kringgå problemet med dålig dye penetration, har vi och andra använt en genetiskt kodade sond, mCherry::pHluorin4,5,6,7, som kan uttryckas specifikt i cellen typer av intresse och avbildad i levande vävnad. pHluorin är en variant av GFP med en högre pKa (~ 7.0 vs. ~ 4.0) som fälls lättare vid högre pH; så totalt fluorescensintensiteten som avges från en population av pHluorin molekyler i cellen ökar med ökande pHi8. Viktigt, är fluorescens linjär inom det normala cytosoliska pHi värdeintervallet. I kontrast, fluorescensen av mCherry (pKa ~ 4.5) är okänslig mot pH-förändringar inom intervallet cytosoliska. Dessa två reportrar är kovalent kopplade tillsammans som ett enda chimära protein, kodas av en enda öppen behandling ram, så de är alltid närvarande i lika mängder. Förhållandet mellan pHluorin till mCherry fluorescensintensiteten ger därför en mätning av pHi som är normaliserad till koncentrationen av sonden i varje cell. Nyckeltalen kan sedan konverteras till uppskattningar av pHi värden använder en standardkurva som genereras genom att skaffa pHluorin till mCherry nyckeltal från vävnader som har varit utjämnad till kända pH-värden.
Här beskriver vi metoderna för att mäta pHi av epitelial FSC härstamning i Drosophila äggstockarna med mCherry::pHluorin. Denna välkarakteriserad vävnad har använts för att modellera många olika aspekter av epitelial biologi, såsom stamceller självförnyelse och differentiering9,10,11, kollektiva cellmigration12 , samt utveckling och underhåll av cell polaritet13,14. Follikeln epitelet är producerad av två Scheme som bor på den främre kanten av vävnaden i en struktur som kallas de germarium15,16. Dessa celler delar regelbundet under vuxenlivet att själv förnya och producera avkomma, kallas prefollicle celler (PFC), som kan antingen ange nischen och bli en FSC eller differentieras till en av tre olika follikeln celltyper: polar celler, stjälk-celler, eller huvuddel follikeln celler. Vi visade tidigare som vildtyp vävnad, pHi ökar stadigt under de tidiga stadierna av differentiering, från en pHi på cirka 6,8 i Scheme till 7.0 i PFC, till 7,3 i follikeln celler2. Blockerar denna ökning av RNAi Nedslagning av en ubiquitously uttryckt natrium/proton växlare, DNhe2, allvarligt försämrar pFC differentiering, ökar pHi av överuttryck av DNhe2 orsakar en mild överskott differentiering fenotyp. Dessa resultat visar att pHi bibehålls stabilt i den tidiga FSC härstamning och att det kan vara experimentellt ökat eller minskat i vivo. Metoderna som beskrivs här kan användas för att mäta pHi i antingen vildtyp vävnad eller olika former av mutanter vävnader, inklusive RNAi knockdown eller överuttryck använder en Gal4 av intresse och mitotiska kloner.
Här, beskriver vi en metod för mätning av pHi av celler i FSC härstamning inom vildtyp vävnad. Detta protokoll har utvecklats och förfinats under de senaste fem åren, sedan vi först började studera pHi i Drosophila äggstocksvävnad. Under den tiden, har protokollet använts framgångsrikt av flera utredare i vårt labb och på minst fyra olika snurrande skiva och laserscanning Mikroskop. Reproducerbarheten för vår ursprungliga observation, att pHi ökar som celler i FSC släktlinje skilja från stamc…
The authors have nothing to disclose.
Vi tackar Bryne Ulmschneider för bidrag till protokollet och Diane Barber för förslag på manuskriptet. Detta arbete finansierades av ett nationellt institut för hälsa grant GM116384 T.G. Nystul och D.L. frisör.
Fly Stocks | |||
UAS-mCherry::pHluorin[1] | |||
y1 w*;P{GawB}10930/CyO | Bloomington Stock Center | 7023 | |
Act-Gal4 flipout stock | Bloomington Stock Center | 4409 | |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Chemicals for Buffer preparation | |||
NaCl | Sigma Aldrich | S5886 | |
KCl | Sigma Aldrich | P-3911 | |
glucose | Mallinckrodt | 4912 | |
HEPES | Thermo Fisher Scientific | BP310 | |
MgSO4 | Thermo Fisher Scientific | M63 | |
CaCl2 | Sigma Aldrich | C-5080 | |
HCO3 | Sigma Aldrich | S-5761 | |
MgCl2 | Sigma Aldrich | M-9272 | |
NMDG+ | Sigma Aldrich | M-2004 | |
K2HPO4 | Mallinckrodt | 7088 | Use to Make KHPO4 pH 7.4 |
KH2PO4 | Thermo Fisher Scientific | BP362 | Use to Make KHPO4 pH 7.4 |
Concanavalin A, Alexa Fluor 647 Conjugate | Thermo Fisher Scientific | C21421 | 0.25 mg/ml dilution |
Nigericin | Thermo Fisher Scientific | N1495 | |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Dissection and mounting tools | |||
2 Dumont Inox forceps (Size 5) | Thermo Fisher Scientific | NC9473431 | |
2 23-gauge syringe needles | Sigma Aldrich | Z192457 | |
9-well glass dissecting dish | Thermo Fisher Scientific | 13-748B | |
Vacuum Grease | Dow Corning | 1018817 | |
22 X 40 mM glass coverslips | Thermo Fisher Scientific | 12545C | |
Round Glass Coverslips, 12mm diameter, 0.13-0.16mm thickness | Ted Pella, Inc. | 26023 | |
3-D mounting chamber | custom manufactured | .stl and .ipt files for 3-D printer included as supplemental files | |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Other equipment | |||
pH meter | Thermo Fisher Scientific | 13-620-183A | Model: Accumet AB15 |
Dissection microscope | Olympus Corporation | 0H11436 | Model: SZ2-ST |
Confocal Microscope | Leica Biosystems | SP5 or SP8 laser-scanning confocal microscope with a 40× objective with a numerical aperture of 1.3 |