Analisi enzimatica fluorometrica cell-free biochimico per la misura di High-throughput di perossidazione lipidica in lipoproteina ad alta densità
Summary
Descriviamo qui un’analisi fluorometrica senza cellula biochimica per la determinazione di HDL-perossidazione lipidica. Questo test rapido e riproducibile può essere utilizzato per determinare la funzione di HDL in studi su larga scala e può contribuire alla nostra comprensione della funzione di HDL nella malattia umana.
Abstract
Lipoproteina ad alta densità bassa di livelli di colesterolo (HDL-C) sono uno dei più potenti predittori negativi indipendenti della malattia cardiovascolare aterosclerotica (CVD). La struttura e la funzione di HDL piuttosto che HDL-C può predire più accuratamente l’aterosclerosi. Si verificano diversi HDL del lipido e della proteina compositivo modifiche che alterano la funzione di HDL negli Stati infiammatori come l’aterosclerosi. Funzione di HDL è solitamente determinato dalla cella basata saggi come saggio di efflusso di colesterolo ma queste analisi hanno numerosi inconvenienti mancanza di standardizzazione. Analisi senza cellula possono dare misure più robuste della funzione di HDL rispetto alle analisi cell-based. Ossidazione di HDL altera la funzione di HDL. HDL ha un ruolo importante nel trasporto perossido lipidico ed elevata quantità di perossidi del lipido è relativo a funzione anormale di HDL. Interazioni lipido-sonda dovrebbero essere considerati quando l’interpretazione dei risultati di fluorescenza non enzimatici dosaggi per misurare lo stato ossidativo del lipido. Questo ci ha motivato a sviluppare un metodo enzimatico senza cellula biochimico per valutare HDL perossido contenuto lipidico (HDLox) che contribuisce a disfunzione di HDL. Questo metodo si basa sulla perossidasi di rafano (HRP) e il fluorocromo rosso di Molceular che può quantificare (senza colesterolo ossidasi) il contenuto di perossido lipidico per mg di HDL-C. Qui è un protocollo describedfor determinazione di HDL-perossidazione lipidica utilizzando il reagente fluorocromo. Variabilità di dosaggio può essere ridotto dalla rigorosa standardizzazione delle condizioni sperimentali. I valori più alti di HDLox sono associati con ridotta funzione antiossidante di HDL. La lettura di questo test è associata con le letture di analisi cell-based convalidate, misure sostitutive di malattia cardiovascolare, l’infiammazione sistemica, disfunzione immune e fenotipi associati rischio cardiovascolare e metabolico. Questo approccio tecnico è un metodo affidabile per valutare la funzione di HDL nella malattia umana dove l’infiammazione sistemica, stress ossidativo e lipidi ossidati hanno un ruolo chiave (come l’aterosclerosi).
Introduction
Malattia aterosclerotica cardiovascolare (CVD) è la principale causa di morte nel mondo1,2. Studi epidemiologici hanno dimostrato che bassi livelli di colesterolo della lipoproteina ad alta densità (HDL) sono generalmente associati inversamente con il rischio per lo sviluppo di aterosclerosi1,2. Anche se parecchi studi sostengono un ruolo atheroprotective per HDL1,2, il meccanismo con cui HDL attenua l’inizio e la progressione di aterosclerosi è complesso 3,4. Così, è stato suggerito che la complessa struttura e la funzione di assoluto livello di HDL piuttosto che può prevedere più accuratamente aterosclerosi 5,6,7,8. Si verificano diversi HDL del lipido e della proteina compositivo modifiche che alterano la funzione di HDL negli Stati infiammatori come l’aterosclerosi. Questi i) ridurre le potenziali efflusso di colesterolo 9, ii) diminuire anti-infiammatori e aumentare HDL-collegati di proteine pro-infiammatorie 6,7, iii) ridurre i livelli di fattore antiossidante e attività e HDL capacità di inibire l’ossidazione delle lipoproteine a bassa densità (LDLox)10 e iv) aumentare del lipido del perossido d’idrogeno contenuto e redox attività (HDLox)9,11. Saggi di robusti che valutano le funzioni di pleotropic di HDL (ad esempio di efflusso di colesterolo, funzione antiossidante) possono complementare determinazione del HDL-HDL-C nella clinica.
La funzione di HDL è solitamente valutata dai metodi basati su cellule quali il colesterolo efflusso dosaggio8,12,13,14. Questi metodi hanno limiti principali tra cui eterogeneità significativa per quanto riguarda i tipi di celle utilizzate, il tipo di lettura segnalata, mancanza di standardizzazione ed effetti confondenti di trigliceridi 7,15. Questi inconvenienti pongono difficoltà per grandi studi clinici16. Analisi senza cellula possono dare misure più robuste della funzione di HDL rispetto alle analisi cell-based. L’efflusso di colesterolo è una delle funzioni più importanti di HDL, ma può essere determinato solo da analisi cell-based. Altri approcci per determinare la funzione di HDL come proteomica17,18,19,20,21,22,23, 24 e chemiotassi del monocito basati su cellule di HDL funzione 17,22,25 non sono state standardizzate e non può essere utilizzati negli studi umani su larga scala.
HDL ha antiossidanti significative atheroprotective effetto5,6,7,8. La funzione antiossidante di HDL è stata determinata in presenza di LDL in precedente cella analisi fluorometriche gratis 26. Questi metodi fluorometrica biochimici della funzione antiossidante di HDL sono stati originariamente sviluppati da Mohamad Navab e Alan Fogelman e loro colleghi26. Anche se molti studi umani hanno utilizzato questi metodi per determinare HDL funzione 17,18,19,20,21,22,23 ,24, lipidi (HDL)-lipidica (LDL) e interazioni lipido-fluorocromo possono limitare la riproducibilità di questi saggi biochimici non enzimatico libero delle cellule del HDL funzione27,28.
L’interesse recente si è concentrata sulle conseguenze funzionali dell’ossidazione di HDL che è il risultato dell’ossidazione di lipidi e di proteine all’interno di HDL 27,29,30. Studi precedenti hanno dimostrato che l’ossidazione di HDL altera HDL funzione 27,29,30. HDL ha un ruolo importante nel trasporto perossido lipidico ed elevata quantità di perossidi del lipido è relativo a funzione anormale di HDL. Così il contenuto di perossido lipidico HDL può essere utilizzato per determinare HDL funzione 9,17,20,31 e dato le limitazioni note di analisi preventiva di HDL funzione7, 15,27,32, abbiamo sviluppato un metodo fluorimetrico alternativo che quantifica HDL lipidi perossido contenuto (HDLox) 32. Questo metodo si basa sulla perossidasi di rafano (HRP) e il fluorocromo rosso di Molceular che può quantificare (senza colesterolo ossidasi) il contenuto di perossido lipidico per mg di HDL-C 32. Il principio biochimico del dosaggio è mostrato nella Figura 1. Abbiamo dimostrato che questo approccio basato sulla fluorescenza non ha le limitazioni del precedente HDL funzione saggi27,28. Questo test è stato ulteriormente affinato e standardizzato nel nostro laboratorio in modo che può essere utilizzato in modo affidabile negli studi umani su larga scala anche con crioconservati plasma 32,33,34, 35 , 36 , 37 , 38 , 39 , 40 , 41 , 42. la lettura di questo test è associata con le letture di analisi cell-based convalidate, misure sostitutive della malattia cardiovascolare, l’infiammazione sistemica, disfunzione immune e fenotipi associati rischio cardiovascolare e metabolico 32 , 33 , 34 , 35 , 36 , 37 , 38 , 39. qui, Descriviamo questo metodo semplice, ma robusto per misurare il contenuto di perossido lipidico di HDL (HDLox). Questo test utilizzabile come strumento per rispondere alle domande di ricerca importante per quanto riguarda il ruolo della funzione di HDL nella malattia umana dove l’infiammazione sistemica, stress ossidativo e lipidi ossidati hanno un ruolo chiave (come l’aterosclerosi)32.
Protocol
Representative Results
Discussion
Il protocollo descritto qui offre un robusto strumento per rispondere alle domande di ricerca importante per quanto riguarda il ruolo della funzione di HDL nell’aterosclerosi e nella malattia umana. Il dosaggio quantifica il contenuto di perossido lipidico HDL per mg di HDL-C usando amplificazione enzimatica (HRP). Questo approccio evita limitazioni note di saggi per la funzione di HDL preventiva (ad es. il saggio di efflusso di colesterolo) tra cui eterogeneità significativa per quanto riguarda i tipi di celle utilizza…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Gli autori riconoscono con gratitudine il lavoro del Dr Mohamad Navab, Alan Fogelman e Srinivasa Reddy per il loro ruolo chiave nello sviluppo di precedenti iterazioni di questo modello. T.A.A. è supportato da un RMIT University Vice-Cancelliere di Postdoctoral Fellowship. AJ e AH sono supportati da NHMRC progetto grant 1108792. TK è supportato da NIH concede NIH K08AI08272, Grant NIH/NCATS # µL1TR000124.
Materials
| Experimental Reagents | |||
| HDL PEG (Polyethylene Glycol) Precipitating Reagent | Pointe Scientific | H7511 | |
| Amplex Red reagent. | Life Technologies, Grand Island, NY | A12216 | Amplex Red Cholesterol Assay Kit. • ≤–20°C • Desiccate • Protect from light |
| DMSO. | Life Technologies, Grand Island, NY | A12216 | Amplex Red Cholesterol Assay Kit. • ≤–20°C • Desiccate • Protect from light |
| Horse Radish Peroxidase (HRP) | Life Technologies, Grand Island, NY | A12216 | Amplex Red Cholesterol Assay Kit. • ≤–20°C • Desiccate • Protect from light |
| Cholesterol Esterase. | Life Technologies, Grand Island, NY | A12216 | Amplex Red Cholesterol Assay Kit. • ≤–20°C • Desiccate • Protect from light |
| Cholesterol Reference standard | Life Technologies, Grand Island, NY | A12216 | Amplex Red Cholesterol Assay Kit. • ≤–20°C • Desiccate • Protect from light |
| Resorufin fluorescense Reference standard | Life Technologies, Grand Island, NY | A12216 | Amplex Red Cholesterol Assay Kit. • ≤–20°C • Desiccate • Protect from light |
| 5x Reaction Buffer. | Life Technologies, Grand Island, NY | A12216 | Amplex Red Cholesterol Assay Kit. • ≤–20°C • Desiccate • Protect from light |
| HDL Cholesterol Automated Reagent | ThermoFisher Scientific Co., San Jose, CA, USA. | TR39601 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Plasticware | |||
| 96-well plates (polypropylene, flat bottom, clear). | Sigma Aldrich | M0687 | |
| 96-well plates (polypropylene, flat bottom, black). | Sigma Aldrich | M9936 | |
| 1.5 mL Eppendorf tubes | Eppendorf | 0030 125.150 | |
| ClipTip 200, sterile | ThermoFisher Scientific Co., San Jose, CA, USA. | 14-488-058 | |
| Thermo Scientific Multichannel Pipettes, 8-channel, 125 | ThermoFisher Scientific Co., San Jose, CA, USA. | 14-387–955 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Software | |||
| Gen5 2.01 software | Biotek, Vermont, USA | NA | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| Gen5 Plate reader | Biotek, Vermont, USA | NA |
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