Her beskriver vi en fluorometric celle-fri biokjemiske analysen for fastsettelse av HDL-lipid peroxidation. Denne raske og reproduserbar analysen kan brukes til å bestemme HDL-funksjonen i stor skala studier og kan bidra til vår forståelse av HDL-funksjonen i menneskelig sykdom.
Lav high-density lipoprotein (HDL-C) kolesterol nivåer er en av de mektigste uavhengig negative prediktorer for aterosklerotisk kardiovaskulær sykdom (CVD). Struktur og funksjon av HDL i stedet for HDL-C kan mer nøyaktig forutsi åreforkalkning. Flere HDL protein og lipid kompositoriske endringer som svekke HDL-funksjonen forekommer i inflammatoriske tilstander som atherosclerosis. HDL-funksjonen er vanligvis avhengig av cellen basert analyser som kolesterol middelklasseinnbyggere analysen men disse analyser har mange ulemper mangelen på standardisering. Cellen gratis analyser kan gi mer robust tiltak av HDL funksjonen sammenlignet cellebasert analyser. HDL oksidasjon svekker HDL-funksjonen. HDL har en viktig rolle i lipid peroxide transport og høy mengde lipid peroksider gjelder unormal HDL-funksjonen. Lipid-sonden interaksjoner bør vurderes når tolke resultatene av ikke-enzymatisk fluorescens søk for å måle lipid oksidativt staten. Dette motivert oss å utvikle en celle-fri biokjemiske enzymatisk metode for å vurdere HDL lipid peroxide innhold (HDLox) som bidrar til HDL dysfunksjon. Denne metoden er basert på enzymet pepperrotperoksidase (HRP) og fluorochrome Amplex rødt som kan kvantifisere (uten kolesterol oksidase) lipid peroxide innholdet per mg av HDL-C. Her er en describedfor fastsettelse av HDL-lipid peroxidation bruker fluorochrome reagensen. Analysen variasjon kan reduseres med strenge standardisering av eksperimentelle forhold. Høyere verdier for HDLox er forbundet med redusert HDL antioksidant funksjon. Presentasjon av denne analysen er forbundet med readouts av validerte cellen-basert analyser, surrogat tiltak av hjerte-og karsykdommer, systemisk betennelse, immun dysfunction og tilknyttete risikoen for hjerte- og metabolske fenotyper. Denne tekniske tilnærmingen er robust metode for å vurdere HDL-funksjonen i menneskelig sykdom der systemisk betennelse, oksidativt stress og oksidert lipider har en nøkkelrolle (som atherosclerosis).
Aterosklerotisk kardiovaskulær sykdom (CVD) er den ledende årsaken til død verdensomspennende1,2. Epidemiologiske studier har vist at lave nivåer av high-density lipoprotein (HDL) kolesterol er generelt omvendt assosiert med risiko for utvikling av aterosklerose1,2. Selv om flere studier støtter en atheroprotective rolle for HDL1,2, er mekanismen som HDL attenuates Debutalder og progresjon av aterosklerose komplekse 3,4. Derfor har det blitt antydet at kompleks struktur og funksjon av HDL i stedet for absolutte nivå kan mer nøyaktig forutsi aterosklerose 5,6,7,8. Flere HDL protein og lipid kompositoriske endringer som svekke HDL-funksjonen forekommer i inflammatoriske tilstander som atherosclerosis. Disse i) redusere sitt kolesterol middelklasseinnbyggere potensielle 9, ii) redusere anti-inflammatorisk og øke HDL-assosiert pro-inflammatoriske proteiner 6,7, iii) redusere antioksidant faktor nivåer og aktivitet og HDL muligheten til å hindre oksidasjon av lav tetthet Lipoprotein (LDLox)10 og iv) øke lipid hydroperoxide innhold og redoks aktivitet (HDLox)9,11. Robuste analyser som evalueres pleotropic funksjoner HDL (for eksempel kolesterol middelklasseinnbyggere, antioksidant funksjon) kan utfylle fastsettelse av HDL-HDL-C i klinikken.
HDL-funksjonen er vanligvis vurdert av cellebasert metoder som de kolesterol middelklasseinnbyggere analyse8,12,13,14. Disse metodene har store begrensninger inkludert betydelige heterogenitet med hensyn til typer celler brukes, type avlesning rapportert, mangelen på standardisering og forvirrende effekter triglyserider 7,15. Disse ulempene utgjør problemer for store kliniske studier16. Cellen gratis analyser kan gi mer robust tiltak av HDL funksjonen sammenlignet cellebasert analyser. Kolesterol middelklasseinnbyggere er en av de viktigste funksjonene av HDL, men det kan bare bestemmes av cellebasert analyser. Andre tilnærminger til å bestemme HDL-funksjon som Proteomikk17,18,19,20,21,22,23, 24 og cellebasert monocytt chemotaxis analyser HDL funksjonen 17,22,25 ikke er standardisert og kan ikke brukes i stor skala menneskelige studier.
HDL har betydelig antioksidant atheroprotective effekt5,6,7,8. Funksjonen antioksidant av HDL er fastslått i nærvær av LDL i forrige cellen gratis fluorometric analyser 26. Metodene for biokjemiske fluorometric HDL antioksidant funksjonen ble opprinnelig utviklet av Mohamad Navab og Alan Fogelman og deres kolleger26. Selv om mange menneskelige studier har brukt disse metodene til å bestemme HDL funksjonen 17,18,19,20,21,22,23 ,24, lipid (HDL)-lipid (LDL) og lipid-fluorochrome vekselsvirkningene kan begrense reproduserbarhet av disse cellen gratis ikke-enzymatisk biokjemiske analyser av HDL funksjonen27,28.
Siste interesse har fokusert på funksjonell konsekvensene av HDL oksidasjon som er resultatet av oksidasjon av både lipider og proteiner i HDL 27,29,30. Tidligere studier har vist at oksidasjon av HDL svekker HDL funksjonen 27,29,30. HDL har en viktig rolle i lipid peroxide transport og høy mengde lipid peroksider gjelder unormal HDL-funksjonen. Dermed kan HDL lipid peroxide brukes til å bestemme HDL funksjon 9,17,20,31 og gitt de kjente begrensningene i tidligere analyser av HDL funksjon7, 15,27,32, vi utviklet en alternativ fluorometric metode som quantifies HDL lipid peroxide innhold (HDLox) 32. Denne metoden er basert på enzymet pepperrotperoksidase (HRP) og fluorochrome Amplex rødt som kan kvantifisere (uten kolesterol oksidase) lipid peroxide innholdet per mg av HDL-C 32. Biokjemiske prinsippet om analysen er vist i figur 1. Vi har vist at dette fluorescens tilnærming ikke har begrensninger av tidligere HDL funksjonen analyser27,28. Denne analysen har blitt ytterligere forbedret og standardisert i vårt laboratorium slik at den kan trygt brukes i stor skala menneskelige studier selv med cryopreserved plasma 32,33,34, 35 , 36 , 37 , 38 , 39 , 40 , 41 , 42. presentasjon av denne analysen er forbundet med readouts av validerte cellen-basert analyser, surrogat tiltak av hjerte-og karsykdommer, systemisk betennelse, immun dysfunction og tilknyttete risikoen for hjerte- og metabolske fenotyper 32 , 33 , 34 , 35 , 36 , 37 , 38 , 39. her beskriver vi denne enkle, men likevel robust metode for å måle HDL lipid peroxide innhold (HDLox). Denne analysen kan brukes som et verktøy til å besvare viktige forskningen spørsmål om rollen av HDL funksjon i menneskelig sykdom der systemisk betennelse, oksidativt stress og oksidert lipider har en nøkkelrolle (som atherosclerosis)32.
Protokollen beskrevet her tilbyr et kraftig verktøy for å besvare viktige forskningen spørsmål om rollen av HDL funksjon i åreforkalkning og menneskelig sykdom. Analysen kvantifiserer HDL lipid peroxide innholdet per mg av HDL-C benytter enzymatisk utvidelse (HRP). Unngår denne tilnærmingen kjente begrensninger av tidligere HDL funksjonen analyser (f.eks kolesterol middelklasseinnbyggere analysen) inkludert betydelige heterogenitet med hensyn til typer celler brukes, type avlesning rapportert, mangelen på standar…
The authors have nothing to disclose.
Forfatterne anerkjenner takknemlig arbeidet til Dr. Mohamad Navab, Alan Fogelman og Srinivasa rødlig for sin viktige rolle i utviklingen av tidligere gjentakelser av denne modellen. T.A.A. støttes av en RMIT University-Visekanslers postdoktorstipend. AJ og AH støttes av NHMRC prosjekt stipend 1108792. TK støttes av NIH gir NIH K08AI08272, NIH/NCATS Grant # µL1TR000124.
Experimental Reagents | |||
HDL PEG (Polyethylene Glycol) Precipitating Reagent | Pointe Scientific | H7511 | |
Amplex Red reagent. | Life Technologies, Grand Island, NY | A12216 | Amplex Red Cholesterol Assay Kit. • ≤–20°C • Desiccate • Protect from light |
DMSO. | Life Technologies, Grand Island, NY | A12216 | Amplex Red Cholesterol Assay Kit. • ≤–20°C • Desiccate • Protect from light |
Horse Radish Peroxidase (HRP) | Life Technologies, Grand Island, NY | A12216 | Amplex Red Cholesterol Assay Kit. • ≤–20°C • Desiccate • Protect from light |
Cholesterol Esterase. | Life Technologies, Grand Island, NY | A12216 | Amplex Red Cholesterol Assay Kit. • ≤–20°C • Desiccate • Protect from light |
Cholesterol Reference standard | Life Technologies, Grand Island, NY | A12216 | Amplex Red Cholesterol Assay Kit. • ≤–20°C • Desiccate • Protect from light |
Resorufin fluorescense Reference standard | Life Technologies, Grand Island, NY | A12216 | Amplex Red Cholesterol Assay Kit. • ≤–20°C • Desiccate • Protect from light |
5x Reaction Buffer. | Life Technologies, Grand Island, NY | A12216 | Amplex Red Cholesterol Assay Kit. • ≤–20°C • Desiccate • Protect from light |
HDL Cholesterol Automated Reagent | ThermoFisher Scientific Co., San Jose, CA, USA. | TR39601 | |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Plasticware | |||
96-well plates (polypropylene, flat bottom, clear). | Sigma Aldrich | M0687 | |
96-well plates (polypropylene, flat bottom, black). | Sigma Aldrich | M9936 | |
1.5 mL Eppendorf tubes | Eppendorf | 0030 125.150 | |
ClipTip 200, sterile | ThermoFisher Scientific Co., San Jose, CA, USA. | 14-488-058 | |
Thermo Scientific Multichannel Pipettes, 8-channel, 125 | ThermoFisher Scientific Co., San Jose, CA, USA. | 14-387–955 | |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Software | |||
Gen5 2.01 software | Biotek, Vermont, USA | NA | |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Equipment | |||
Gen5 Plate reader | Biotek, Vermont, USA | NA |