Cell-free biokemiska Fluorometric enzymatisk analys för High-throughput mätning av lipidperoxidation i hög Density Lipoprotein
Summary
Vi beskriver här en fluorometric cellfria biokemisk analys för bestämning av HDL-lipidperoxidation. Denna snabba och reproducerbara analys kan användas för att bestämma HDL funktion i storskaliga studier och kan bidra till vår förståelse av HDL funktion i mänskliga sjukdomar.
Abstract
Låg high-density lipoprotein kolesterol (HDL-C) nivåer är en av de mest kraftfulla oberoende negativa prediktorer av aterosklerotisk hjärt-kärlsjukdom (CVD). Struktur och funktion av HDL i stället för HDL-C kan mer exakt förutsäga åderförkalkning. Flera förändras HDL protein och lipid sammansättning som försämrar HDL funktionen i inflammatoriska stater som åderförkalkning. HDL funktion bestäms vanligtvis av cellbaserade analyser såsom kolesterol efflux assay men dessa analyser har många nackdelar brist på standardisering. Cellfria analyser kan ge mer robusta åtgärder av HDL funktion jämfört med cellbaserade analyser. HDL oxidation försämrar HDL funktion. HDL har en viktig roll i lipid peroxid transport och hög mängd lipid peroxider är relaterad till onormal HDL funktion. Lipid-probe interaktioner bör beaktas när tolkningen av resultaten av icke-enzymatiska fluorescens analyser för mätning av lipid oxidativ tillståndet. Detta motiverade oss att utveckla en cellfria biokemiska enzymatisk metod för att bedöma HDL peroxid fettinnehållet (HDLox) som bidrar till HDL dysfunktion. Denna metod är baserad på det enzym pepparrotsperoxidas (HRP) och fluorokrom Amplex röd som kan kvantifiera (utan kolesterol oxidas) peroxid fettinnehållet per mg HDL-C. Här är ett protokoll describedfor bestämning av HDL-lipidperoxidation använder fluorokrom reagensen. Assay variabilitet kan minskas genom strikta standardisering av experimentella förhållanden. Högre HDLox värden är associerade med reducerad HDL antioxidant funktion. Avläsningen av denna analys är associerad med avläsning av validerade cellbaserade analyser, surrogat åtgärder av kardiovaskulär sjukdom, systemisk inflammation, immun dysfunktion och associerade kardiovaskulära och metabola risk fenotyper. Detta tekniska tillvägagångssätt är en robust metod att bedöma HDL funktion i mänskliga sjukdomar där systemisk inflammation, oxidativ stress och oxiderade lipider har en nyckelroll (såsom åderförkalkning).
Introduction
Aterosklerotisk hjärt-kärlsjukdom (CVD) är den ledande orsaken till dödsfall i världen1,2. Epidemiologiska studier har visat att låga nivåer av high-density lipoprotein (HDL) kolesterol är i allmänhet omvänt samband med risk för utveckling av åderförkalkning1,2. Även om flera studier stöder en kärlskyddande roll för HDL1,2, är mekanismen genom vilken HDL dämpar initiering och progression av åderförkalkning komplexa 3,4. Det har därför föreslagits att komplexa struktur och funktion av HDL i stället för absoluta nivå mer exakt kan förutsäga åderförkalkning 5,6,7,8. Flera förändras HDL protein och lipid sammansättning som försämrar HDL funktionen i inflammatoriska stater som åderförkalkning. Dessa i) minska dess kolesterol efflux potentiella 9, (ii) minska antiinflammatoriska och ökar HDL-associerade pro-inflammatoriska proteiner 6,7, iii) minskning antioxidant faktor nivåer och aktivitet och HDLs förmåga att hämma oxidation av Low Density Lipoprotein (LDLox)10 och iv) öka lipid butylhydroperoxid innehåll och redox aktivitet (HDLox)9,11. Robusta analyser som utvärderar de pleotropic funktionerna av HDL (såsom kolesterol efflux, antioxidant funktion) kan komplettera bestämning av HDL-HDL-C i kliniken.
HDL funktion bedöms vanligtvis av cellbaserade metoder såsom kolesterol efflux assay8,12,13,14. Dessa metoder har stora begränsningar inklusive betydande heterogenitet när det gäller typer av celler används, typ av avläsning rapporterade, brist på standardisering och störande effekter av triglycerider 7,15. Dessa nackdelar innebära svårigheter för stora kliniska studier16. Cellfria analyser kan ge mer robusta åtgärder av HDL funktion jämfört med cellbaserade analyser. Av kolesterol utflödet är en av de viktigaste funktionerna av HDL, men det kan bara bestämmas av cellbaserade analyser. Andra metoder att bestämma HDL funktion såsom proteomik17,18,19,20,21,22,23, 24 och cellbaserade monocyt chemotaxis analyser av HDL funktion 17,22,25 har inte standardiserats och kan inte användas i stor skala humanstudier.
HDL har betydande antioxidant kärlskyddande effekt5,6,7,8. Den antioxidant funktionen av HDL har fastställts i närvaro av LDL i föregående cell gratis fluorometric analyser 26. Dessa biokemiska fluorometric metoder av HDL antioxidant funktion utvecklades ursprungligen av Mohamad Navab och Alan Fogelman och deras kollegor26. Även om många studier har använt dessa metoder för att bestämma HDL funktion 17,18,19,20,21,22,23 ,24, blodfetter (HDL)-lipid (LDL) och lipid-fluorokrom interaktioner kan begränsa reproducerbarhet av dessa cell gratis icke-enzymatiska biokemiska analyser av HDL funktion27,28.
Senaste intresse har fokuserat på de funktionella konsekvenserna av HDL oxidation som är resultatet av oxidation av både lipider och proteiner inom HDL 27,29,30. Tidigare studier har visat att oxidation av HDL försämrar HDL funktion 27,29,30. HDL har en viktig roll i lipid peroxid transport och hög mängd lipid peroxider är relaterad till onormal HDL funktion. Således kan HDL peroxid fettinnehållet användas för att bestämma HDL funktion 9,17,20,31 och gett kända begränsningar av tidigare analyser av HDL funktion7, 15,27,32, vi utvecklat en alternativ fluorometric metod som kvantifierar HDL lipid peroxidhalten (HDLox) 32. Denna metod är baserad på det enzym pepparrotsperoxidas (HRP) och fluorokrom Amplex röd som kan kvantifiera (utan kolesterol oxidas) peroxid fettinnehållet per mg HDL-C 32. Biokemiska principen av analysen visas i figur 1. Vi har visat att denna fluorescens-baserade strategi inte har begränsningarna i föregående HDL funktion analyser27,28. Denna analys har ytterligare förfinats och standardiserat i vårt laboratorium så att den på ett tillförlitligt sätt kan användas i storskaliga mänskliga studier även med frysförvarade plasma 32,33,34, 35 , 36 , 37 , 38 , 39 , 40 , 41 , 42. avläsningen av denna analys är associerad med avläsning av validerade cellbaserade analyser, surrogat åtgärder av kardiovaskulär sjukdom, systemisk inflammation, immun dysfunktion och associerade kardiovaskulära och metabola risk fenotyper 32 , 33 , 34 , 35 , 36 , 37 , 38 , 39. här, vi beskriver denna enkla, men ändå robust metod för att mäta HDL peroxid fettinnehållet (HDLox). Denna analys kan användas som ett verktyg för att besvara viktiga forskningsfrågor om rollen av HDL funktion i mänskliga sjukdomar där systemisk inflammation, oxidativ stress och oxiderade lipider har en nyckelroll (såsom åderförkalkning)32.
Protocol
Representative Results
Discussion
Protokollet beskrivs här erbjuder ett robust verktyg för att besvara viktiga forskningsfrågor om rollen av HDL funktion i åderförkalkning och mänskliga sjukdomar. Analysens kvantifierar HDL peroxid fettinnehållet per mg HDL-C med hjälp av enzymatisk amplifiering (HRP). Detta tillvägagångssätt undviker kända begränsningar av tidigare HDL funktion analyser (t.ex. kolesterol efflux analysen) inklusive betydande heterogenitet när det gäller typer av celler används, typ av avläsning rapporterade, brist på st…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Författarna erkänner tacksamt arbete Dr Mohamad Navab, Alan Fogelman och Srinivasa Reddy för sin nyckelroll i utvecklingen av tidigare iterationer av denna modell. T.A.A. stöds av en RMIT University rektors postdoktorsstipendium. AJ och AH stöds av NHMRC projektbidrag 1108792. TK stöds av NIH beviljar NIH K08AI08272, NIH/NCATS bidrag nr µL1TR000124.
Materials
| Experimental Reagents | |||
| HDL PEG (Polyethylene Glycol) Precipitating Reagent | Pointe Scientific | H7511 | |
| Amplex Red reagent. | Life Technologies, Grand Island, NY | A12216 | Amplex Red Cholesterol Assay Kit. • ≤–20°C • Desiccate • Protect from light |
| DMSO. | Life Technologies, Grand Island, NY | A12216 | Amplex Red Cholesterol Assay Kit. • ≤–20°C • Desiccate • Protect from light |
| Horse Radish Peroxidase (HRP) | Life Technologies, Grand Island, NY | A12216 | Amplex Red Cholesterol Assay Kit. • ≤–20°C • Desiccate • Protect from light |
| Cholesterol Esterase. | Life Technologies, Grand Island, NY | A12216 | Amplex Red Cholesterol Assay Kit. • ≤–20°C • Desiccate • Protect from light |
| Cholesterol Reference standard | Life Technologies, Grand Island, NY | A12216 | Amplex Red Cholesterol Assay Kit. • ≤–20°C • Desiccate • Protect from light |
| Resorufin fluorescense Reference standard | Life Technologies, Grand Island, NY | A12216 | Amplex Red Cholesterol Assay Kit. • ≤–20°C • Desiccate • Protect from light |
| 5x Reaction Buffer. | Life Technologies, Grand Island, NY | A12216 | Amplex Red Cholesterol Assay Kit. • ≤–20°C • Desiccate • Protect from light |
| HDL Cholesterol Automated Reagent | ThermoFisher Scientific Co., San Jose, CA, USA. | TR39601 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Plasticware | |||
| 96-well plates (polypropylene, flat bottom, clear). | Sigma Aldrich | M0687 | |
| 96-well plates (polypropylene, flat bottom, black). | Sigma Aldrich | M9936 | |
| 1.5 mL Eppendorf tubes | Eppendorf | 0030 125.150 | |
| ClipTip 200, sterile | ThermoFisher Scientific Co., San Jose, CA, USA. | 14-488-058 | |
| Thermo Scientific Multichannel Pipettes, 8-channel, 125 | ThermoFisher Scientific Co., San Jose, CA, USA. | 14-387–955 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Software | |||
| Gen5 2.01 software | Biotek, Vermont, USA | NA | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| Gen5 Plate reader | Biotek, Vermont, USA | NA |
Referências
- Gordon, D. J., Rifkind, B. M. High-density lipoprotein–the clinical implications of recent studies. N Engl J Med. 321, 1311-1316 (1989).
- Rubins, H. B., et al. Gemfibrozil for the secondary prevention of coronary heart disease in men with low levels of high-density lipoprotein cholesterol. Veterans Affairs High-Density Lipoprotein Cholesterol Intervention Trial Study Group. N Engl J Med. 341, 410-418 (1999).
- Voight, B. F., et al. Plasma HDL cholesterol and risk of myocardial infarction: a mendelian randomisation study. Lancet. 380, 572-580 (2012).
- Navab, M., Reddy, S. T., Van Lenten, B. J., Fogelman, A. M. HDL and cardiovascular disease: atherogenic and atheroprotective mechanisms. Nat.Rev Cardiol. 8, 222-232 (2011).
- Navab, M., et al. The double jeopardy of HDL. Ann Med. 37, 173-178 (2005).
- Navab, M., Reddy, S. T., Van Lenten, B. J., Anantharamaiah, G. M., Fogelman, A. M. The role of dysfunctional HDL in atherosclerosis. J Lipid Res. 50, S145-S149 (2009).
- Navab, M., Reddy, S. T., Van Lenten, B. J., Fogelman, A. M. HDL and cardiovascular disease: atherogenic and atheroprotective mechanisms. Nat Rev Cardiol. 8, 222-232 (2011).
- Patel, S., et al. Reconstituted high-density lipoprotein increases plasma high-density lipoprotein anti-inflammatory properties and cholesterol efflux capacity in patients with type 2 diabetes. J Am Coll Cardiol. 53, 962-971 (2009).
- Navab, M., et al. HDL and the inflammatory response induced by LDL-derived oxidized phospholipids. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 21, 481-488 (2001).
- Hayek, T., Oiknine, J., Brook, J. G., Aviram, M. Role of HDL apolipoprotein E in cellular cholesterol efflux: studies in apo E knockout transgenic mice. Biochem Biophys Res Commun. 205, 1072-1078 (1994).
- Van Lenten, B. J., et al. Anti-inflammatory HDL becomes pro-inflammatory during the acute phase response. Loss of protective effect of HDL against LDL oxidation in aortic wall cell cocultures. J Clin Invest. 96, 2758-2767 (1995).
- Undurti, A., et al. Modification of high density lipoprotein by myeloperoxidase generates a pro-inflammatory particle. J Biol Chem. 284, 30825-30835 (2009).
- Van Lenten, B. J., et al. Lipoprotein inflammatory properties and serum amyloid A levels but not cholesterol levels predict lesion area in cholesterol-fed rabbits. J Lipid Res. 48, 2344-2353 (2007).
- Watson, C. E., et al. Treatment of patients with cardiovascular disease with L-4F, an apo-A1 mimetic, did not improve select biomarkers of HDL function. J Lipid Res. 52, 361-373 (2011).
- Annema, W., et al. Impaired HDL cholesterol efflux in metabolic syndrome is unrelated to glucose tolerance status: the CODAM study. Sci Rep. 6, 27367 (2016).
- Movva, R., Rader, D. J. Laboratory assessment of HDL heterogeneity and function. Clin Chem. 54, 788-800 (2008).
- Charles-Schoeman, C., et al. Abnormal function of high-density lipoprotein is associated with poor disease control and an altered protein cargo in rheumatoid arthritis. Arthritis Rheum. 60, 2870-2879 (2009).
- Imaizumi, S., et al. L-4F differentially alters plasma levels of oxidized fatty acids resulting in more anti-inflammatory HDL in mice. Drug Metab Lett. 4, 139-148 (2010).
- Khera, A. V., et al. Cholesterol efflux capacity, high-density lipoprotein function, and atherosclerosis. N Engl J Med. 364, 127-135 (2011).
- Morgantini, C., et al. Anti-inflammatory and antioxidant properties of HDLs are impaired in type 2 diabetes. Diabetes. 60, 2617-2623 (2011).
- Patel, P. J., Khera, A. V., Jafri, K., Wilensky, R. L., Rader, D. J. The anti-oxidative capacity of high-density lipoprotein is reduced in acute coronary syndrome but not in stable coronary artery disease. J Am Coll Cardiol. 58, 2068-2075 (2011).
- Watanabe, J., et al. Proteomic profiling following immunoaffinity capture of high-density lipoprotein: association of acute-phase proteins and complement factors with proinflammatory high-density lipoprotein in rheumatoid arthritis. Arthritis Rheum. 64, 1828-1837 (2012).
- Watanabe, J., et al. Differential association of hemoglobin with proinflammatory high density lipoproteins in atherogenic/hyperlipidemic mice. A novel biomarker of atherosclerosis. J Biol Chem. 282, 23698-23707 (2007).
- Watanabe, J., et al. Hemoglobin and its scavenger protein haptoglobin associate with apoA-1-containing particles and influence the inflammatory properties and function of high density lipoprotein. J Biol Chem. 284, 18292-18301 (2009).
- Wang, X. S., et al. A sensitive and specific ELISA detects methionine sulfoxide-containing apolipoprotein A-I in HDL. J Lipid Res. 50, 586-594 (2009).
- Navab, M., et al. A cell-free assay for detecting HDL that is dysfunctional in preventing the formation of or inactivating oxidized phospholipids. J Lipid Res. 42, 1308-1317 (2001).
- Kelesidis, T., et al. A biochemical fluorometric method for assessing the oxidative properties of HDL. J Lipid Res. 52, 2341-2351 (2011).
- Kelesidis, T., et al. Effects of lipid-probe interactions in biochemical fluorometric methods that assess HDL redox activity. Lipids Health Dis. 11, 87 (2012).
- Navab, M., et al. Mechanisms of disease: proatherogenic HDL–an evolving field. Nat Clin Pract Endocrinol Metab. 2, 504-511 (2006).
- Navab, M., et al. The oxidation hypothesis of atherogenesis: the role of oxidized phospholipids and HDL. J Lipid Res. 45, 993-1007 (2004).
- Morgantini, C., et al. HDL lipid composition is profoundly altered in patients with type 2 diabetes and atherosclerotic vascular disease. Nutr Metab Cardiovasc Dis. 24, 594-599 (2014).
- Kelesidis, T., et al. A high throughput biochemical fluorometric method for measuring lipid peroxidation in HDL. PLoS One. 9, e111716 (2014).
- Kelesidis, T., Yang, O. O., Kendall, M. A., Hodis, H. N., Currier, J. S. Dysfunctional HDL and progression of atherosclerosis in HIV-1-infected and -uninfected adults. Lipids Health Dis. 12, 23 (2013).
- Zanni, M. V., et al. HDL redox activity is increased in HIV-infected men in association with macrophage activation and non-calcified coronary atherosclerotic plaque. Antivir Ther. 19, 805-811 (2014).
- Roberts, C. K., Katiraie, M., Croymans, D. M., Yang, O. O., Kelesidis, T. Untrained young men have dysfunctional HDL compared with strength-trained men irrespective of body weight status. J Appl Physiol (1985). , 1043-1049 (2013).
- Davidson, W. S., et al. Weight loss surgery in adolescents corrects high-density lipoprotein subspecies and their function. Int J Obes (Lond). 41, 83-89 (2017).
- Kelesidis, T., et al. Predictors of impaired HDL function in HIV-1 infected compared to uninfected individuals. J Acquir Immune Defic Syndr. , (2017).
- Kelesidis, T., et al. Oxidized lipoproteins are associated with markers of inflammation and immune activation in HIV-1 infection. AIDS. 30, 2625-2633 (2016).
- Kelesidis, T., et al. Changes in plasma levels of oxidized lipoproteins and lipoprotein subfractions with atazanavir-, raltegravir-, darunavir-based initial antiviral therapy and associations with common carotid artery intima-media thickness: ACTG 5260s. Antivir Ther. , (2016).
- Bhattacharyya, D. K., Adak, S., Bandyopadhyay, U., Banerjee, R. K. Mechanism of inhibition of horseradish peroxidase-catalysed iodide oxidation by EDTA. Biochem J. 295 (Pt 2), 281-288 (1994).
- Rees, M. D., Pattison, D. I., Davies, M. J. Oxidation of heparan sulphate by hypochlorite: role of N-chloro derivatives and dichloramine-dependent fragmentation. Biochem J. 391, 125-134 (2005).
- Mani, K., Cheng, F., Fransson, L. A. Heparan sulfate degradation products can associate with oxidized proteins and proteasomes. J Biol Chem. 282, 21934-21944 (2007).
- Finley, P. R., Schifman, R. B., Williams, R. J., Lichti, D. A. Cholesterol in high-density lipoprotein: use of Mg2+/dextran sulfate in its enzymic measurement. Clin Chem. 24, 931-933 (1978).
- von Schenck, H., Jacobsson, M. L. Prothrombin assay standardized with an international normalization ratio (INR): goal and reality. Clin Chem. 33, 342 (1987).
- de Kok, J. B., et al. Normalization of gene expression measurements in tumor tissues: comparison of 13 endogenous control genes. Lab Invest. 85, 154-159 (2005).
- Stocker, R., Keaney, J. F. Role of oxidative modifications in atherosclerosis. Physiol Rev. 84, 1381-1478 (2004).
- Holzer, M., et al. Aging affects high-density lipoprotein composition and function. Biochim Biophys Acta. 1831, 1442-1448 (2013).
- Amundson, D. M., Zhou, M. Fluorometric method for the enzymatic determination of cholesterol. J Biochem Biophys Methods. 38, 43-52 (1999).
- Mishin, V., Gray, J. P., Heck, D. E., Laskin, D. L., Laskin, J. D. Application of the Amplex red/horseradish peroxidase assay to measure hydrogen peroxide generation by recombinant microsomal enzymes. Free Radic Biol Med. 48, 1485-1491 (2010).
- Lombardi, A., et al. UCP3 translocates lipid hydroperoxide and mediates lipid hydroperoxide-dependent mitochondrial uncoupling. J Biol Chem. 285, 16599-16605 (2010).
- Bhattacharya, A., et al. Denervation induces cytosolic phospholipase A2-mediated fatty acid hydroperoxide generation by muscle mitochondria. J Biol Chem. 284, 46-55 (2009).
- Havel, R. J., Eder, H. A., Bragdon, J. H. The distribution and chemical composition of µLtracentrifugally separated lipoproteins in human serum. J Clin Invest. 34, 1345-1353 (1955).
- Dyerberg, J. Comments on the quantitation of lipoproteins by agarose-gel electrophoresis. Clin Chim Acta. 61, 103-104 (1975).
- Warnick, G. R., Cheung, M. C., Albers, J. J. Comparison of current methods for high-density lipoprotein cholesterol quantitation. Clin Chem. 25, 596-604 (1979).
- Demacker, P. N., Hijmans, A. G., Vos-Janssen, H. E., van’t Laar, A., Jansen, A. P. A study of the use of polyethylene glycol in estimating cholesterol in high-density lipoprotein. Clin Chem. 26, 1775-1779 (1980).
- Izzo, C., Grillo, F., Murador, E. Improved method for determination of high-density-lipoprotein cholesterol I. Isolation of high-density lipoproteins by use of polyethylene glycol 6000. Clin Chem. 27, 371-374 (1981).
- Patel, P. J., Khera, A. V., Wilensky, R. L., Rader, D. J. Anti-oxidative and cholesterol efflux capacities of high-density lipoprotein are reduced in ischaemic cardiomyopathy. Eur J Heart Fail. 15, 1215-1219 (2013).
- Roche, M., Rondeau, P., Singh, N. R., Tarnus, E., Bourdon, E. The antioxidant properties of serum albumin. FEBS Lett. 582, 1783-1787 (2008).
- Panzenbock, U., Kritharides, L., Raftery, M., Rye, K. A., Stocker, R. Oxidation of methionine residues to methionine sulfoxides does not decrease potential antiatherogenic properties of apolipoprotein A-I. J Biol Chem. 275, 19536-19544 (2000).
