O ensaio de reconstituição de organoides (ORA) para a análise funcional do tronco Intestinal e nicho de células

Resumo

Organoides intestinal culturas são estabelecidas de criptas toda e não permitem a análise de auto-renovação e diferenciação em uma célula específica de moda. Este protocolo descreve a reconstituição da haste classificada (Lgr5⁺) e células (Paneth), que dão origem a organoids permitindo sua prévia modificação genética e bioquímica e análise funcional de nicho.

Resumo

O epitélio intestinal é caracterizado por uma taxa extremamente rápida de volume de negócios. Nos mamíferos, o forro epithelial todo se renova dentro de 4-5 dias. Células-tronco adultas intestinais residem no fundo das criptas de Lieberkühn, são afectadas pela expressão do gene Lgr5 e preservar a homeostase através de sua característica alta taxa proliferativa¹. Ao longo do intestino delgado, Lgr5⁺ células-tronco são entremeadas com células secretoras especializadas, chamadas células de Paneth. Células de Paneth secretam compostos antibacterianos (i.e., lisozima e cryptdins/defensinas) e exercem um papel de controlo sobre a flora intestinal. Mais recentemente, foi descoberta uma nova função para as células de Paneth, ou seja, sua capacidade para fornecer suporte de nicho de células-tronco Lgr5⁺ através de vários ligantes chaves como Wnt3, EGF e Dll1².

Quando isolada ex vivo e cultivados na presença de fatores de crescimento específicos e componentes da matriz extracelular, criptas intestinais todo dão origem a long-lived e auto renovar estruturas 3D chamado organoids que muito se assemelham a cripta-vilosidades arquitetura epitelial do intestino delgado adulto³. Organoides culturas, quando estabelecida de toda criptas, permitem o estudo de auto-renovação e diferenciação de nicho de células-tronco intestinal, embora sem abordar a contribuição dos seus componentes individuais, ou seja a Lgr5⁺ e Células de Paneth.

Aqui, descrevemos uma nova abordagem para o ensaio de organoides que aproveita a capacidade de Paneth e células de Lgr5⁺ para associar e formar organoids quando cultivadas co. Esta abordagem, aqui referida como "ensaio de reconstituição de organoides" (ORA), permite a modificação genética e bioquímica de Paneth ou Lgr5⁺ células-tronco, seguidas por reconstituição em organoids. Como tal, permite a análise funcional dos dois principais componentes do nicho de células-tronco intestinal.

Introdução

O epitélio intestinal é o tecido mais rapidamente auto renovadora no corpo dos mamíferos e, como tal, tem sido objeto de uma infinidade de estudos vista a identificação e caracterização funcional das células-tronco adultas que residem no fundo da cripta de Lieberkühn, afectada pela expressão do gene Lgr5 e dependente de sinais de Wnt canônico¹. Nomeadamente, Lgr5⁺ células-tronco são flanqueadas e suportadas por células especializadas de nicho, ou seja, células de Paneth, que também dependem de sinalização de Wnt para sua maturação². Juntos, esses tipos de duas células subjacentes a a....

Protocolo

Todos os procedimentos foram realizados de acordo com as diretrizes e leis de bem-estar animal local.

1. preparação dos instrumentos, meios de cultura e pratos

1. Conjunto de autoclave 1 de intestinal tesoura, tesoura normal e fórceps em recipiente estéril.
2. Coloque um prato de 96 poços (fundo plano) em uma incubadora a 37 ° C.
3. Prepare-se 10 mL de meio de cultura completo com os reagentes listados na tabela de materiais.
4. Incube o meio completo a 37 ° C em banho-maria.
5. Degelo reconstituído a membrana basal, colocando-o em um balde de gelo. A membrana basal reconstituída se tornará líquida a 4 ° C....

Resultados

O ensaio de reconstituição de organoides permite a análise funcional separada dos componentes essenciais da ameia e células-tronco do epitélio intestinal, aqui demonstrado pelo RNA de interferência pequeno (siRNA) do gene Apc .

Para atingir este objectivo, primeiro utilizamos o fluorescente ativado celular classificação (FACS) para separar puras camundongos C57BL6/J 8000 Lgr5⁺ de células e 6000 célul.......

Discussão

O ORA permite a análise funcional refinada dos dois componentes essenciais de nicho de células-tronco intestinal, ou seja, Lgr5⁺ e células de Paneth. Esta abordagem tem sido empregada anteriormente por nós e outros, com pequenas modificações,^6,10,11. Aqui, apresentamos o procedimento ORA como um protocolo do laboratório reproduzíveis e padronizada. Além disso, relatamos sobre os efeitos da Apc downre.......

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Advanced DMEM F12 *	Thermo Fisher Scientific	12634-010
Glutamax *	Thermo Fisher Scientific	35050061	Concentração final: 10 mM
Penicilina/estreptomicina *	Thermo Fisher Scientific	15140122	Concentração final: 1%
Hepes *	Thermo Fisher Scientific	15630080	Concentração final: 10 mM
EGF murino recombinante *	Thermo Fisher Scientific	PMG8041	Concentração final: 50 ng/ml
Noggin murino recombinante *	Peprotech	250-38	Concentração final: 100 ng/ml
y27632 *	Sigma	Y0503	Concentração final: 10 µ M
Jagged-1 *	Anaspec Bio	AS-61298	Concentração final: 1 µ M
R-espondina murina recombinante *	R& D systems	3474-RS-050	Concentração final: 1 mg/ml
Flexitube Gene solution siRNA APC	Qiagen	GS11789	Concentração final: 100 nM
Lipofectamine 2000	Thermo Fisher Scientific	11668019
CD24 APC	Biolegend	101814
c-kit PE	Biolegend	105808
BV 421 CD31	Biolegend
BV 421 CD45	Biolegend	103134
BV421 TER119	Biolegend	116234
HBSS	Thermo Fisher Scientific	14180046
B6.129P2-Lgr5tm1(cre/ERT2)Cle/J	Jackson Laboratories	008875
Tubos de baixa ligação	Eppendorf	Z666548-250EA
Matrigel	Corning	356230
* A combinação desses reagentes constitui o meio

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