En hög genomströmning kall fysiska plasma behandlingsprotokoll av vätskor och celler visas. Det handlar om att sätta upp olika gastillförseln kompositioner för plasma tändning, mäta plasma’s utsläpp spectra, och efterföljande analys av vätskor och cellulär aktivitet efter plasmabehandling.
I plasma medicin tillämpas joniserat gaser med temperaturer nära ryggradsdjur system på celler och vävnader. Kall plasmor generera reaktiv arter kända redox reglera biologiska processer vid hälsa och sjukdom. Prekliniska och kliniska bevis pekar på positiva effekter av plasmabehandling i läkning av kroniska sår i huden. Andra framväxande ämnen, såsom plasma cancerbehandling, får allt större uppmärksamhet. Plasma medicinsk forskning kräver tvärvetenskaplig kompetens inom fysik, kemi och biomedicin. Ett mål av plasmaforskning är att karakterisera plasma-behandlade celler i en rad specifika program. Detta omfattar till exempel celltal och livskraft, cellulära oxidation, mitokondriell aktivitet, cytotoxicitet och läge av celldöd, cellcykeln analys, cell surface markör uttryck och cytokinfrisättning. Denna studie beskriver viktig utrustning och arbetsflöden som krävs för sådan forskning i plasma biomedicin. Det beskriver funktionsduglighet i ett atmosfäriskt tryck argon plasma jet, särskilt övervaka dess grundläggande utsläpp spectra och foder gas inställningar för att modulera reaktiva arter utdata. Med en hög precision xyz-tabell och datorprogramvara, är jet svävade i millisekund precision över hålrum av 96 brunnar i mikrometer precision för maximal reproducerbarhet. Nedströms analyser för flytande analys av redox-aktiva molekyler visas, och målceller är plasma-behandlade. Specifikt, melanomceller analyseras i en effektiv sekvens av olika på varandra följande analyser men använder samma celler: mätning av metabolisk aktivitet, summacell område och ytan markör uttryck för calreticulin, en molekyl som är viktigt för den immunogent celldöd av cancerceller. Dessa analyser hämta innehåll-rika biologiska information om plasma effekter från en enda skylt. Sammantaget beskriver denna studie de grundläggande stegen och protokoll för plasma medicinsk forskning.
Reaktiva arter är viktiga redox tillsynsmyndigheter i sjukdom, inklusive onormal sårläkning1 och cancer. 2 ännu viktigare, dessa arter är involverade i patologi samt dess terapeutiska beslut. 3 , 4 kalla fysiska plasma är en joniserad gas att fördriver reaktiva arter av många slag. 5 sedan tillkomsten av så kallade kalla plasmor som verkar på kroppen temperaturen6, kall plasma kan tillämpas på celler och vävnader utan termisk skada. Genom att påvisa effekt och säker tillämpning av plasma enheter i prekliniska och kliniska observationer, har tre fått ackreditering som medicintekniska produkter i Tyskland. 7 särskilt när det gäller genotoxiska säkerhet, har flera studier visat avsaknad av mutagena händelser med hjälp av den första enheten, ett atmosfäriskt tryck argon plasma jet. 8 , 9 , 10 de andra två enheterna är så kallade dielektrisk barriär utsläpp (DBD), som verkar via en annan princip än plasma jet. Specifikt, möjliggör jets skalpell-liknande behandling av ytor och håligheter DBD plasmor är effektiv vid behandling av större men ganska platt vävnad områden. Att utnyttja cellulära redox signalering11, är syftet med tekniken att utnyttja plasma-genererade reaktiva arter för biomedicinska tillämpningar. 12 en särskilt lovande tillämpning av kliniska plasma terapi är stöd av sårläkning. 13 , 14 , 15 vidare plasma visade sig ha cancer effekter i djurmodeller. 16 , 17 , 18
Innan du validerar effekt och säkerhet av plasma applikationer i djurmodeller, eller även människor, standardiserade in vitro- forskning måste utföras med plasma enheter. Dessa experiment är nödvändigt att utforska plasma applikationer och att avgränsa mekanismerna i arbetet. Dessutom behövs grundläggande forskning att förstå effekterna av sammansättningen av reaktiva arter och efterföljande biologiska effekter. Denna studie visar hur plasma kan integreras i biomedicinsk forskning för att bättre förstå och kontrollera dess effekter på celler. Det beskriver trimning av gastillförseln sammansättning, övervakning av reaktiva arter utdata, tillämpningar av plasma att vätskor och vävnader, celler, och de resulterande kemiska och biologiska utfall. Dessutom finns exempel som instruera om standardisering av plasmabehandling och nedströms biologiska analyser, med en betoning på plasma medicinsk forskning görs i 96 brunnar. Detta tillvägagångssätt har tydliga fördelar: jag) minimering av antalet celler som behövs per skick, reagens kostnader och praktiska tid per prov; (II) avdrag på större noggrannhet av resultat som dubbletter eller tre exemplar behandlingar kan ställas in med lätthet; och iii) underlättande av sömlösa nedströms testmetoder i Plattläsare med 96 brunnar format, imaging och flöde flödescytometri experiment.
Grundforskning är grundläggande för att utveckla en förståelse för effekten av och mekanismer som underbygger plasma medicin i preklinisk och klinisk forskning. Grundläggande forskning främjar också utredning av nya applikationer för behandlingar. Medan det är väletablerat att plasmor medla deras biologiska effekter via generation av reaktivt syre och kväve arter19, finns det fortfarande tre huvudsakliga utmaningar till fältet. Vilka arter är det första viktiga? Detta kan delvis besvaras genom att modulera plasmor med optisk diagnostik och biologiska utläsningar gastillförseln sammansättning. 20 för det andra, vilka effekter kan ses i biologiska mål såsom celler? Detta är, åtminstone delvis, adresseras med cell kultur experiment och ett antal analyser. I eukaryota celler, effekter är pleiotropiska inklusive cellcykeln gripandet21, apoptos22, nekros23, och huden cell stimulering24,25,26, samt ett stöd eller minskning av cell motilitet eller metabolisk aktivitet27,28,29. Den tredje utmaningen, avser dessa pleiotropiska effekter, är att identifiera viktiga molekyler som avgör den cellulära svaren på plasmaderiverade oxidanter att förklara olika effekter ses ofta i olika celltyper. Detta kan göras genom omics tekniker30,31,32 och/eller upp eller nedreglering av målgener med siRNA (redox) signalering-hämmare, antioxidanter och antioxidativa enzymer, samt modulering av den plasma’s reaktiva arter utdata. 33 , 34 , 35 därför strömlinjeformad assay protokoll behövs för att testa större provningssatser med stort antal iterationer.
Denna studie exemplifierar ett effektivt experimentella arbetsflöde, från fysik till biologi, för plasma medicinsk forskning när det gäller de nämnda utmaningarna. Information om de tekniska aspekterna av plasma källan och plasma generation har beskrivits tidigare. 36 , 37 , 38 som alla av dessa analyser utförs i 96well pläterar, som har ett antal fördelar. Exempelvis kan prover, såsom cell cellkulturer enkelt transporteras från analys till samlingsplattor att utreda, till exempel protein koncentrationer via enzym-länkade–immunosorbentanalys. Om det finns vetenskapliga utrustning som kan läsa direkt från 96-wells en sådan strategi minimerar kostnader per prov och handsontime och maximerar resultat genom multiplexing olika analyser från samma prov. Användning av multikanal pipetter dessutom påskyndar provhantering. I princip kan analysen beskrivs här också utföras med hjälp av väl platta format med större väl diametrar, även om detta skulle kräva ytterligare pipettering steg in i andra rör och fartyg för nedströms analyser. Mindre tallrik typer såsom 384well tallrikar, dock utgör inte geometri passar biomedicinsk plasmaforskning med jets med stora gastillförseln flussmedel. Specifikt, kan det inte garanteras att endast enstaka men inte intilliggande brunnar påverkas under en behandling.
Flytande analys är viktigt att undersöka arter nedfall av plasma. I expertanalyser, kan en parallell installation av olika analyser karakterisera plasmatreated vätskor när det gäller olika oxidanter samtidigt. Detta multiplexing kan utveckla en differentierad bild av plasmaderived arter. Den beskrivna metoden är mycket känslig för undersöka väteperoxid koncentrationer39, vilket ofta är nödvändigt men inte alltid tillräckligt att förklara plasma effekter. 40 , 41 , 42 biologiskt relevanta effekter kan också bedömas i vätskor med en glutation-analys som inte ingår här. 43 den specifika nitrit-test rekommenderas starkt över konventionella Griess-analyser på grund av 10fold högre analysens känslighet (inga data anges). Plasmatreated vätskor kan också undersökas för bildandet av hypokloritsyra med DTNB-analys. Ändå tidigare resultat tyder inte bildandet av arten med vår plasma källa. 19 , 39 , 44 efter plasma behandlingen har avslutats, arter försämring sker över tid. Nitrit reagerar på nitrat; också, peroxid förbrukas över tiden. Men ta dessa processer flera timmar. 35 cytokrom c absorption är stabil över flera timmar också. Därför, om processer inträffar inom de första 30 min efter behandling, variation i koncentrationer av de långlivade arter som beskrivs här är försumbar. Men man måste vara försiktig när undersöka vissa typer av media (t.ex., Dulbeccos den Eagle Medium) som ingredienser kan rensa upp till 90% peroxid inom 1 h (inga data anges) leder till en underskattning av plasma peroxid nedfall i vätskor.
En multiplex assay presenteras som sträcker sig från att utreda metabolisk aktivitet över cellområde (morfologi) till cell surface markör uttryck. En kombination av dessa analyser kan avslöja intressanta resultat. Exempelvis har vi tidigare visat i THP1 monocyter att metaboliska aktivitet och cell räknas inte minskar linjärt efter exponering för plasma. 45 snarare, med ökande plasma behandlingstid, celler sågs som ökade i storlek och hade en högre mitokondriemassa, vilket leder till högre ämnesomsättning priser på basis av percell. Kombinationen av multiplate läsare, mikroskopi och flödescytometri multiplexer i huvudsak information om cellulära svar efter plasmabehandling. I melanomceller fokuserar vi här på cytotoxiska effekter och deras immunogenicitet medieras av calreticulin. 46 i princip många andra frågor kan ställas med detta synsätt som förbinder metabolisk aktivitet med imaging och flöde flödescytometri resultat. Till exempel kan celldifferentiering (e.g. makrofag polarisering), mitokondriella membranet potential, cellcykeln analys, cell motilitet, biomekanik eller mikrokärntest bildandet för analys av genotoxicitet också undersökas i plasma-behandlade celler. Multicolor flödescytometri möjliggör ännu mer applikationer i olika cellpopulationer samtidigt. Detta omfattar till exempel analys av phosphorylation status signalering proteiner som transkriptionsfaktorer, mRNA kvantifiering, mätning av intracellulära cytokiner, eller bedömning av total minskad tioler på en enda cell-nivå. Ytterligare biologiskt relevant information som är tillgänglig för varje prov hjälpmedel ytterligare utveckla bilden av plasma redox effekter att bättre förstå nuvarande och framtida plasma applikationer.
The authors have nothing to disclose.
Finansiering från tyska förbundsministeriet för utbildning och forskning (BMBF bevilja nummer 03Z22DN11 och 03Z22DN12) är erkänt tacksamt.
accutase | BioLegend | 423201 | |
amplex Ultra Red detection kit (includes horse-radish peroxidase and H2O2) | Thermo | A36006 | |
argon gas | Air Liquide | N50 | |
B16F10 murine melanoma cells | ATCC | CRL-6475 | |
catalase | Sigma | C30 | |
cell culture incubator | Binder | CB210 | |
cell culture plastic | NUNC | 156545 | |
cytochrome c, oxidized | Sigma | C2037 | |
data analysis | GraphPad software | prism 7.03 | |
fetal bovine serum | Sigma | batch-tested | |
fine scale | any with resolution of 0.01mg | ||
flow cytometer | Beckman-Coulter | CytoFlex S | |
flow cytometry data analysis | Beckman-Coulter | Kaluza 1.5a | |
Glutamine | Sigma | G7513 | |
imaging quantification software | PerkinElmer | Harmony 4.5 | |
laminar flow hood | Thermo | Maxisafe 2020 | |
mass flow controller | MKS | G-series | |
Measure-iT nitrite detection kit | Thermo | M36051 | |
microscope | PerkinElmer | Operetta CLS | |
optical emssion spectroscopy | Avantes | AvaSpec-DDDD-2-USB2 | |
penicilin/streptomycin | Thermo | 15140122 | |
pipettes | Eppendorf/Brand | single/multi chanel | |
plate reader | Tecan | M200pro | |
propidium iodide | BioLegend | 421301 | |
resazurin | VWR | B21187.06 | |
RPMI1640 cell culture media | PanbioTech | P04-16500 | |
xyz table | CNC step | HIGH-Z S-400/T |