Praktiske overvejelser i studere metastatisk lunge kolonisering i Osteosarcoma ved hjælp af pulmonale metastaser Assay
Summary
Målet med denne artikel er at give en detaljeret beskrivelse af protokollen til pulmonale metastaser assay (PuMA). Denne model giver forskere til at studere metastatisk osteosarkom (OS) cellevækst i lungevæv ved hjælp af en widefield fluorescens eller Konfokal laser-scanning mikroskop.
Abstract
Den pulmonale metastaser assay (PuMA) er en ex vivo lunge eksplantat og lukkede celle kultur system, der tillader forskere til at studere biologi af lunge kolonisering i osteosarkom (OS) ved Fluorescens mikroskopi. Denne artikel giver en detaljeret beskrivelse af protokollen, og diskuterer eksempler på at opnå billeddata på metastatisk vækst ved hjælp af widefield eller Konfokal Fluorescens mikroskopi platforme. Fleksibiliteten i PuMA model tillader forskere til at studere ikke blot væksten af OS celler i lunge mikromiljø, men også til at vurdere virkningerne af anti-metastatisk therapeutics over tid. Konfokal mikroskopi giver mulighed for hidtil uset, høj opløsning billeder af OS celle interaktioner med lunge parenkym. Desuden PuMA model er kombineret med fluorescerende farvestoffer eller fluorescerende proteiner genetiske journalister, kan forskere studere lunge mikromiljø, cellulært og subcellulært strukturer, genfunktioner og promotor aktivitet i metastatisk OS celler. PuMA model giver et nyt værktøj til osteosarkom forskere til at opdage nye metastase biologi og vurdere aktiviteten af roman anti-metastatisk, målrettede behandlinger.
Introduction
Bedre resultater for pædiatriske patienter med metastatisk osteosarkom (OS) er stadig en kritisk udækket kliniske behov 1. Dette understreger betydningen af at udvikle nye molekylært målrettet behandlingsformer. Konventionelle kemoterapeutika, at målet tumor celle spredning ikke har vist sig for at være effektiv i behandling af metastatisk sygdom, og dermed nye strategier skal målrette metastatisk processen selv 2. Den nuværende artikel diskuterer de praktiske aspekter af en forholdsvis ny type af ex vivo lunge metastase model, pulmonale metastaser assay (PuMA) udviklet af Mendoza og kolleger3, som giver et nyttigt redskab til at opdage nye Molekylær drivere i lunge metastase progression i OS 4,5. Før du fortsætter, men det ville være klogt at kort berøre flere aktuelle modeller af metastaser, og hvordan PuMA model tilbyder flere fordele i forhold til konventionelle in vitro- undersøgelser.
Mest eksperimentelle modeller bruges til at studere metastase består af in vitro- og i vivo systemer, at sammenfatte enten et bestemt trin eller flere trin af den metastatiske kaskade. Disse skridt omfatter: 1) tumor celler migrerer fra den primære tumor, 2) intravasation i nærheden fartøjer (blod eller lymfe) og transit inden for omsætning, 3) arrestere på sekundære site, 4) ekstravasation og overlevelse på den sekundære site, 5) dannelse af micrometastases, og 6) væksten i vaskulariserede metastaser (figur 1). In vitro modeller af metastaser kan omfatte 2-dimensionelle (2D) migration og 3-dimensionelle (3D) Matrigel invasion assays, som gennemgås i detaljer andetsteds 6. For i vivo modeller, de to almindeligt anvendte modelsystemer omfatter: 1) den spontane metastase model er hvor en tumorceller er orthotopically indsprøjtes i en bestemt vævstype til at danne en lokal tumor, der spontant kaster metastaserende celler til fjerne steder; 2) den eksperimentelle metastase model er, hvor tumorceller er sprøjtet ind i blodkar opstrøms af målorgan. For eksempel, en hale vene injektion af tumor celler resultater i udvikling lunge metastaser5,7,8. Andre eksperimentelle metastase modeller omfatter injektion af tumorceller i milt eller mesenteriallymfeknuderne vene, hvilket resulterer i udvikling af lever metastaser9,10. Praktiske overvejelser af disse i vivo modeller er drøftet i detaljer af Welch 11. En anden i vivo model brugt til at studere metastase i pediatric sarkomer er nyre nyre subkapsulær tumor implantation modellen, hvilket resulterer i lokale tumordannelse og spontane metastaser til lungerne 12,13. En mere teknisk krævende teknik som intravital videomicroscopy kan direkte visualisere, i real-time, interaktioner mellem metastatisk kræftceller og microvasculature af en metastatisk websted (dvs. lungerne eller leveren) som beskrevet af MacDonald14 og Entenberg15, eller kræft celle ekstravasation i chorioallantoic membranen som beskrevet af Kim 16.
PuMA-model er en ex vivo, lunge væv eksplantat, lukkede kultur system hvor væksten af fluorescerende tumorceller kan langs observeres via Fluorescens mikroskopi over en periode på en måned (Se figur 2A). Denne model sammenfatter de indledende stadier af lungekræft kolonisering (trin 3 til 5) i den metastatiske kaskade. Nogle store fordele af PuMA model over konventionelle in vitro- modeller er: 1) det giver mulighed for at måle på langs metastatisk kræft cellevækst i en 3D mikromiljø, der bevarer mange funktioner i lunge mikromiljø i vivo 3; 2) puMA gør det muligt for forskeren at vurdere, om en kandidat gen eller stofmisbrug behandling knockdown har anti-metastatisk aktivitet i forbindelse med en 3D lunge mikromiljø; 3) PuMA-modellen er fleksibel med mange typer af Fluorescens mikroskopi platforme (figur 2B) som widefield Fluorescens mikroskopi eller laser-scanning Konfokal mikroskopi, er eksempler på hver vist i figur 2 c & D, henholdsvis. Denne artikel vil diskutere hvordan PuMA model til at opnå imaging tidsseriedata på metastatisk væksten af forbedrede grøn fluorescerende proteiner (eGFP)-udtrykker, menneskelige høj og lav metastatisk osteosarkom celler (MNNG og HOS cellerne, henholdsvis) ved hjælp af lav forstørrelse widefield fluorescens. Eksempler på imaging et fluorescerende farvestof, som etiketter lunge parenkym, og et rødt-fluorescerende proteiner genetiske reporter, som etiketter mitokondrier i OS celler i PuMA model ved hjælp af laser-scanning konfokalmikroskopi drøftes også.
Protocol
Representative Results
Discussion
Følgende tekniske artiklen beskriver nogle praktiske aspekter af PuMA model i studere lunge kolonisering i OS. Nogle kritiske trin i den protokol, hvor forskere bør tage ekstra pleje omfatter følgende:
en) cannulation af luftrøret. Luftrør kan let beskadiget mens dissekere de omkringliggende muskler og bindevæv. Derudover kan nålen af kateteret nemt skubbes gennem luftrøret. Betale meget opmærksom på hvordan facet af nålen ind i luftrøret ved indsætning af kanylen.
<p class="j…Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi vil gerne takke Dr. Arnulfo Mendoza der har givet træning i PuMA teknik. Derudover vil vi gerne anerkende Drs. Chand Khanna, Susan Garfield (NCI/NIH), og Sam Aparicio (BC kræft Agency) for at give brugen af deres mikroskoper i løbet af denne undersøgelse. Denne forskning blev støttet (delvis) af murene forskningsprogrammet af National Institutes of Health, Center for kræftforskning, pædiatrisk onkologi gren. M.M.L. blev støttet af den nationale institutter af murene besøger Fellow sundhedsprogram (award 15335), og er i øjeblikket understøttes af en Joan Parker Fellowship i metastase forskning. P.H.S. understøttes af British Columbia Cancer Foundation.
Materials
| Table 2 | |||
| Cell culture reagents for A-media, B-media, and complete media | |||
| MNNG-HOS | ATCC | CRL-1547 | highly metastatic OS cell line |
| HOS | ATCC | CRL-1543 | poorly metastatic OS cell line |
| MG63.3 | Amy LeBlanc Laboratory (NCI) | N/A | highly metastatic OS cell line |
| MG63 | ATCC | CRL-1427 | poorly metastatic OS cell line |
| 10X M199 media | Thermofisher | 11825015 | Base media for A-media and B-media |
| Distilled Water (sterilized) | Thermofisher | 15230-147 | Component of A-media & B-media |
| 7.5% sodium bicarbonate solution | Thermofisher | 25080094 | Component of A-media & B-media |
| Hydrocortizone | Sigma-Alrich | H6909 | Component of A-media & B-media |
| Retinol acetate-water soluable | Sigma-Alrich | R0635-5MG | Component of A-media & B-media |
| Penicillin/Streptomycin 10X concentrated (10000 U/ml) solution | Thermofisher | 15140122 | Component of A-media & B-media, complete media. |
| Bovine insulin solution (10mg/ml) | Sigma-Alrich | I0516-5ML | Component of A-media & B-media |
| DMEM, high glucose | Thermofisher | 11965092 | Base media of Complete Media |
| L-Glutamine (200 mM) | Thermofisher | 25030081 | Component of Complete Media |
| Fetal Bovine Serum | Thermofisher | 16000044 | Component of Complete Media |
| Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline | Thermofisher | 14190144 | Used in cell culture. |
| Hank’s Buffered Salts Solution, no calcium, no magnesium, no phenol red | Thermofisher | 14175095 | Used to resuspend cell pellet prior to injection |
| Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red | Thermofisher | 25200114 | Used in cell culture. |
| DAR4M | Enzo | ALX-620-069-M001 | Used to label lung parenchyma. |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Table 3 | |||
| Materials for PuMA | |||
| Zeiss 710 Confocal LSM | Zeiss | N/A | Upright LSM confocal microscope |
| Zeiss 780 Confocal LSM | Zeiss | N/A | Inverted LSM confocal microscope |
| SCID mice | Charles River | N/A | NOD.CB17-Prkdcscid/NcrCrl, female, age 6-8 weeks |
| GelFoam | Harvard Apparatus | 59-9863 | Used as a support for lung tissue sections. |
| SeaPlaque Agarose | Lonza | 50100 | Used during insufflation of the lung. |
| 1 ml syringe with 27 gauge needle | Fisherscientific | 14-826-87 | Used for tail vein injection. |
| 10 ml syringe | BD | 309604 | Used for insufflation of the lung. |
| 20 gauge catheter | Terumo | SR-OX2032CA | Used during insufflation of the lung. |
| Abbott IV extension set (30", Sterile) | Medisca | 8342 | Used during insufflation of the lung. |
| Alcohol swabs | BD | 326895 | For wiping tail vein before injection |
| Sterile surgical gloves | Fisherscientific | Varies with size | Asceptic handing of mouse lungs |
| 30 cm ruler | Staples | Used for insufflation of the lung. | |
| Support stand for ruler | Pipette.com | HS29022A | Used for insufflation of the lung. |
| 35 mm glass-bottomed culture dish | Ibidi | 81158 | Used during imaging of lung slices |
| Absorbent Underpads with Waterproof Moisture Barrier | VWR | 56617-014 | Used to line the sterile work area in the biological hood. |
| Catgut Plain Absorbable Suture | Braun | N/A | Used to tie off cannulated trachea. |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Table 4 | |||
| Surgical instruments for PuMA | |||
| Micro Dissecting Scissors 3.5" Straight Sharp/Sharp | Roboz | RS-5910 | For cutting lung sections |
| 4” (10 cm) Long Serrated Straight Extra Delicate 0.5mm Tip | Roboz | RS-5132 | For manipulating/holding lung sections. |
| 4” (10 cm) Long Serrated Slight Curve 0.8mm Tip | Roboz | RS5135 | For manipulating/holding lung sections. |
| Thumb Dressing Forceps; Serrated; Delicate; 4.5" Length; 1.3 mm Tip Width | Roboz | RS-8120 | For general dissection. |
| Thumb Dressing Forceps 4.5" Serrated 2.2 mm Tip Width | Roboz | RS-8100 | For general dissection. |
| Extra Fine Micro Dissecting Scissors 3.5" Straight Sharp/Sharp, 20mm blade | Roboz | RS-5880 | For general dissection. |
| Knapp Scissors; Straight; Sharp-Blunt; 27mm Blade Length; 4" Overall Length | Roboz | RS-5960 | For general dissection. |
Referências
- Khanna, C., et al. Toward a drug development path that targets metastatic progression in osteosarcoma. Clin Cancer Res. 20 (16), 4200-4209 (2014).
- Steeg, P. S. Perspective: The right trials. Nature. 485 (7400), S58-S59 (2012).
- Mendoza, A., et al. Modeling metastasis biology and therapy in real time in the mouse lung. J Clin Invest. 120 (8), 2979-2988 (2010).
- Hong, S. H., Ren, L., Mendoza, A., Eleswarapu, A., Khanna, C. Apoptosis resistance and PKC signaling: distinguishing features of high and low metastatic cells. Neoplasia. 14 (3), 249-258 (2012).
- Lizardo, M. M., et al. Upregulation of Glucose-Regulated Protein 78 in Metastatic Cancer Cells Is Necessary for Lung Metastasis Progression. Neoplasia. 18 (11), 699-710 (2016).
- Pouliot, N., Pearson, H. B., Burrows, A. Investigating Metastasis Using In Vitro Platforms. Metastatic Cancer: Clinical and Biological Perspectives. , (2012).
- Cameron, M. D., et al. Temporal progression of metastasis in lung: cell survival, dormancy, and location dependence of metastatic inefficiency. Cancer Res. 60 (9), 2541-2546 (2000).
- Morrow, J. J., et al. mTOR inhibition mitigates enhanced mRNA translation associated with the metastatic phenotype of osteosarcoma cells in vivo. Clinical Cancer Research. , (2016).
- Varghese, H. J., et al. In vivo videomicroscopy reveals differential effects of the vascular-targeting agent ZD6126 and the anti-angiogenic agent ZD6474 on vascular function in a liver metastasis model. Angiogenesis. 7 (2), 157-164 (2004).
- Khanna, C., Hunter, K. Modeling metastasis in vivo. Carcinogenesis. 26 (3), 513-523 (2005).
- Welch, D. R. Technical considerations for studying cancer metastasis in vivo. Clin Exp Metastasis. 15 (3), 272-306 (1997).
- Somasekharan, S. P., et al. YB-1 regulates stress granule formation and tumor progression by translationally activating G3BP1. J Cell Biol. 208 (7), 913-929 (2015).
- El-Naggar, A. M., et al. Translational Activation of HIF1alpha by YB-1 Promotes Sarcoma Metastasis. Cancer Cell. 27 (5), 682-697 (2015).
- MacDonald, I. C., Groom, A. C., Chambers, A. F. Cancer spread and micrometastasis development: quantitative approaches for in vivo models. Bioessays. 24 (10), 885-893 (2002).
- Entenberg, D., et al. A permanent window for the murine lung enables high-resolution imaging of cancer metastasis. Nat Methods. 15 (1), 73-80 (2018).
- Kim, Y., et al. Quantification of cancer cell extravasation in vivo. Nat Protoc. 11 (5), 937-948 (2016).
- Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nat Methods. 9 (7), 671-675 (2012).
- Underwood, E. E. . Quantitative stereology. , (1970).
- Tanaka, K., et al. In vivo optical imaging of cancer metastasis using multiphoton microscopy: a short review. Am J Transl Res. 6 (3), 179-187 (2014).
- Prouty, A. M., Wu, J., Lin, D. T., Camacho, P., Lechleiter, J. D. Multiphoton laser scanning microscopy as a tool for Xenopus oocyte research. Methods Mol Biol. 322, 87-101 (2006).
- Bijgaart, R. J., Kong, N., Maynard, C., Plaks, V. Ex vivo Live Imaging of Lung Metastasis and Their Microenvironment. J Vis Exp. (108), e53741 (2016).
- Guha, M., et al. Mitochondrial retrograde signaling induces epithelial-mesenchymal transition and generates breast cancer stem cells. Oncogene. 33 (45), 5238-5250 (2014).
- Ren, L., Morrow, J. J., et al. Positively selected enhancer elements endow osteosarcoma cells with metastatic competence. . Nat Med. , (2018).
- Ren, L., et al. Metabolomics uncovers a link between inositol metabolism and osteosarcoma metastasis. Oncotarget. 8 (24), 38541-38553 (2017).
- Ren, L., et al. Characterization of the metastatic phenotype of a panel of established osteosarcoma cells. Oncotarget. 6 (30), 29469-29481 (2015).
