Условное нокдаун экспрессии генов в рак клеточных линий для изучения набора моноцитов/макрофагов в микроокружения опухоли
Summary
Этот протокол служит схема для создания функциональной системы тет-ON в линии клетки рака и его последующего использования, в частности для изучения роли опухолевых клеток, полученных белков в наборе моноцитов/макрофагов в микроокружения опухоли.
Abstract
siRNA и индуцируемый опосредованной сбить (KD) методы регулирования экспрессии генов имеют неоценимое значение для понимания функции генов и белков. Однако в случае что KD протеина интереса имеет летальный эффект на клетки или ожидаемого эффекта KD время зависимых, безусловный KD методы не подходят. Условное системы являются более подходящими в таких случаях и были предметом особого интереса. К ним относятся экдистероидов индуцибельной гиперэкспрессия систем, индукция цитохрома P-450 системы1, и тетрациклин регулируемых системах выражения гена.
Тетрациклин регулируется ген выражение система позволяет обратимого контроля над выражение протеина путем индукции индуцируемый выражения присутствии тетрациклин. В этом протоколе мы представляем экспериментальный дизайн, с использованием функциональной системы тет-ON в человеческих раковых клеток линии для условного регуляцию экспрессии генов. Мы затем продемонстрировать использование этой системы в исследовании опухолевых клеток Моноцит взаимодействия.
Introduction
Опухоль связанных макрофагов (ТАМС) способствуют развитию опухоли путем поощрения роста опухоли, метастазы и регулирование иммунный ответ2. Раковые клетки набирать воспалительных моноцитов, которые проникновения опухоли и дифференцироваться в про онкогенной ТАМС3. Инфильтрация опухоли с ТАМС коррелирует с плохой клинических исходов и был связан с иммуносупрессивной роли макрофаги4,5. Однако не хорошо изучить механизмы вербовки макрофагов к опухоли и лучшего понимания путей, участие имеет решающее значение для дальнейшего развития области и перспективных методов лечения. Одной из задач в изучении взаимодействия между раковые клетки и нормальные клетки в микроокружения опухоли (ТМЕ) является сложность механизмов и клеток, участвующих, требующих в vitro подходы, которые позволяют рассечение перекрестных помех. Здесь мы представляем универсальный методологии, которые могут быть применены для изучения паракринными эффект клеток рака, секретируемые белки на миграции других типов клеток как макрофаги, в пробирке. С помощью системы, где выражение индуцируемый против рака клеток, полученных белка участвуют в вербовке моноциты находится под контролем промотора индуцибельной тетрациклин, предел паракринными эффект секретируемые белки на моноцитов. В этом протоколе клонирование индуцируемый последовательностей в тетрациклинового ряда, которые представлены регулируемых вектор следуют поколение стабильной рак клеточных линий. Кроме того очистка первичного человека моноцитов и пробирной палаты Бойден, используются для анализа паракринными эффект рака-производных белков на миграцию моноцитов.
Даунрегуляция кодирование генов белка обычно применяется с siRNA и индуцируемый методы, хотя и не без ограничения его использования. Долгосрочный НОК Даун (KD) генов может выявить вторичные Адаптивная реакция клеток, которые мешают экспериментальные результаты. Отсутствие временных контроля над экспрессии генов делает его сложным для изучения динамических роли белка течением времени или роли белка, решающее значение для выживания клетки. Эта проблема особенно важна в настройках в естественных условиях , где роль белка в развитие опухоли и прогрессии может потребовать Даунрегуляция выражения протеина интереса, только после того, как создан опухоли. Условное KD обладает преимуществом предотвращения слишком ранних летальный эффект KD на клетки и для анализа роли белка в различных стадиях опухолевого роста, в то время как безусловное KD может привести в отсутствие развития опухоли.
Ряд условных KD систем были разработаны для устранения ограничений стабильной KD. Системы выражение условного генов включают экдистероидов индуцибельной гиперэкспрессия системы, системы цитохрома P-450 индукции1и тетрациклин регулируемых системах выражения гена. Тетрациклин регулируется генов системы выражения позволяют контролировать выражение индуцируемый после добавления антибиотик Тетрациклин (или его более стабильным аналогом – Доксициклин). В системах тет-ON, выражение индуцируемый индуцируется в присутствии тетрациклин/доксициклин, что приводит к экспрессии генов KD, находясь в Тэт-OFF систем, выражение индуцируемый подавляется присутствии тетрациклин, что приводит к экспрессии генов. Недостатком тетрациклин индуцибельной системы является сообщалось ранее низкий уровень экспрессии индуцируемый в отсутствие доксициклин – так называемые негерметичности6,7. В Тэт-ON системы описано здесь, после отправления тетрациклин, связывание конститутивно выраженной тетрациклин репрессор (тетр) белка в тет отзывчивым последовательности элемент (TRE) в рамках H1, промоутер регион индуцируемый интерес подавлено. Это приводит выражение индуцируемый и ингибирование перевода протеина интереса в обнаруживавшие тетрациклин8,9.
Другие доступные тет-ON системы включают в себя одновременное забивные Тето последовательности между Тата поле и элемент проксимальной последовательности (PSE) и Тата коробки и транскрипции запустить сайт, разработанный Чан и др. 10 эта система требует меньше токсических доз тетрациклина регулировать индуцируемый выражения, однако, под-индуцированной государства, низкий уровень индуцируемый выражаются. Krüppel связанное поле (краб) на основе системы Тет-д11 включает в себя краб, цинковый палец белка, который субъектов гены расположены в диапазоне 3 КБ краб привязки сайта transcriptional подавления. Химерных белка tTRKRAB можно связать Тето, и из-за большого спектр ДНК контролируемый потенциала, Тето не должны ограничиваться между транскрипции начать сайта и промоутер и имеют низкое воздействие на активность промоутер. Под-индуцированной государства этой управляемой системы вмешательства РНК, как сообщается, показывают более низкий уровень экспрессии утечка индуцируемый11,12; Однако это требует последовательных, два вектор клонирования подход. По сравнению с ранее разработанной условного KD систем, таких как экдистероидов индуцибельной гиперэкспрессия системы или системы индукции цитохрома P-450 тетрациклин регулируемые системы имеет преимущество его надежности и обратимости и поэтому наиболее широко используется система13. Системы, используемые в настоящем Протоколе имеет преимущество перед двойной Тето забивные системы и системы краб тет-ON, как это требует прямо вперед, единый вектор клонирования, позволяя быстро поколения несколько клонов, и он имеет очень низкий уровень утечки в отсутствие доксициклин.
TME имеет решающее значение для развития рака. Для облегчения роста опухоли, раковые клетки набирать воспалительных моноциты секретирующих белков эозинофилов. Набранных моноцитов проникновения опухоли и дифференцироваться в про онкогенной ТАМС, влияющих на рост опухоли и метастазов. В vitro исследования вербовки иммунных клеток использовать анализов миграции, с Бойден Пробирной палаты, широко используется14,,1516,17. В этот assay хемотаксического источник белка, например, раковые клетки, или очищенный протеин, помещается в нижней камере. Иммунные клетки находятся в верхней палате разделены с пористые мембраны из отсека снизу. Перенос в сторону увеличения градиента хемотаксического, и тех, кто находится на нижней стороне мембраны клеток окрашенных и рассчитывает под микроскопом. Здесь мы тестируем хемотаксического функция 1 ингибитора активатора плазминогена (PAI-1) на моноцитов, создавая стабильные, индуцибельной рак клеточных линий, где выражение PAI-1 регулируется доксициклин сложения. Мы используем человека первичной моноцитов в Бойден Пробирной палаты миграции для оценки роли PAI-1 в Моноцит миграции. Различия между человека первичной моноцитов и широко используемым monocytic клеточных линий как THP1 поступили и включают различные цитокины выражение шаблоны18; к примеру 5-10 раз повышение уровня ФНО α выражение клетками THP1 по сравнению с человека моноциты19. THP1 клетки являются производными от monocytic клеток человека лейкемии, легко поддерживать и размножаться в среднем время 19-50 h20удвоения. Напротив человека моноциты характеризуются короткий срок при отсутствии факторов роста. Так как моноциты очищаются от крови доноров, изрядное количество изменчивости происходит среди людей и в зависимости от метода очистки может произойти загрязнение с другими типами клеток. Тем не менее основной моноциты имеют отношение и рекомендуется использовать или подтвердить результаты, полученные с monocytic клеточных линий, с помощью первичных моноцитов в биологических исследований19. Здесь мы описываем протокол для очистки человека первичной моноцитов в периферической крови. Альтернативные методы очистки Моноцит включают плотность градиента и адгезии протоколы и два шага процедуры с одной градиенты Ficoll-Hypaque следуют градиента Percoll21. Чистота Моноцит населения, полученные от этих методов колеблется от 70-90%. Метод, описанный здесь использует градиент плотности, следуют отрицательные иммунной выбор22 и позволяет очищению человеческого моноциты без прямого контакта с антителами, тем самым избегая их случайной активации и в результате > 95% чистой населения моноцитов.
Для создания функциональной системы тет-ON для экспрессии генов KD в человеческих раковых клеток линии используется протокол, представленные здесь для изучения эффекта хемотаксического рак производные выделяется белка PAI-1 на моноцитов. PAI-1 оверэкспрессировали разнообразные опухоли и ее выражение парадоксально коррелирует с плохой клинических исходов23,24. Про онкогенной роли PAI-1 является результатом ее про ангиогенных и анти apoptotic функции25,26. PAI-1 было показано вносить воспаление путем поощрения найма макрофаги на сайт воспаления27. PAI-1 было показано для содействия гладких мышц cellmigration28,29 и участвовать в Mac-1 зависимых макрофагов миграции30. Гиперэкспрессия PAI-1 также показало значительно повысить набора сырой 264.7 макрофагов в B16F10 меланома опухоли31. Однако роль PAI-1 в TAM миграции не были расследованы в деталях. Мы используем описать протокол для ответа на вопрос о ли PAI-1 привлекает моноцитов в раковые клетки. Эта методология позволяет рассечение перекрестных помех между опухолью и TME глушителей секретируемые белки в раковых клетках и анализируя компоненты ТМЕ.
Protocol
Representative Results
Discussion
Состоит из различных типов клеток, TME имеет решающее значение для развития рака. Чтобы определить оптимальные условия роста, раковые клетки привлекают моноциты через секрецию эозинофилов факторов. Здесь мы представляем собой протокол для изучения механизма найма Моноцит опухолевых к?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Авторы хотели бы признать Жаклин Розенберг для корректуры рукопись. Эта работа была поддержана США Департамент здравоохранения и социальных служб/национальные институты здравоохранения с Грант для YA DeClerck (Грант 5R01 CA 129377) и TJ Мартелл фонд. MH Кубала является получателем исследования карьеры развития стипендия Сабан научно-исследовательского института Детская больница Лос-Анджелеса.
Materials
| Tet-pLKO-puro lentiviral vector | Addgene | 21915 | |
| FBS (Tetracycline-free) | Omega Scientific | FB-15 | |
| Histopaque | Sigma | 10771-500ML | |
| EasySep Human Monocyte Enrichment Kit | StemCell | 19059 | |
| EasySep Magnet | StemCell | 18002 | |
| EcoRI HF | NEB | R3101S | |
| AgeI HF | NEB | R3552S | |
| Cut Smart buffer | NEB | B7200S | |
| EndoFree Plasmid Maxi Kit | Qiagen | 12362 | |
| PROMEGA Wizard SV Gel and PCR Cleanup System | PROMEGA | A9281 | |
| psPAX vector | Addgene | 12260 | |
| pMD2.G vector | Addgene | 12259 | |
| One Shot Stbl3 Chemically Competent E. coli | Thermo Fisher Scientific | C737303 | |
| Hema 3 stain set for Wright-Giemsa stain | Protocol | 123-869 | |
| HEK293 cells | ATCC | CRL-1573 | |
| PBS | Corning | 21-031-CV | |
| XhoI restriction enzyme | NEB | R0146S | |
| Ligase | NEB | M0202S | |
| Ligase buffer | NEB | M0202S | |
| EDTA 0.5 M solution | Thermo Fisher Scientific | R1021 | |
| Lipofectamine 2000 | Invitrogen | 11668019 | |
| The Big Easy" EasySep Magnet | Stem Cell | 18001 | |
| 0.1% Poly-L-Lysine solution | Sigma-Aldrich | P8920 | |
| Sodium Acetate | Sigma-Aldrich | S7670 | |
| Sodium butyrate | Sigma-Aldrich | B5887 | |
| 0.45 μM syringe filters | VWR International | 28145-479 | |
| NaOH | Sigma-Aldrich | S5881-500g | |
| Tris(hydroxymethyl)aminomethane (Tris) | Invitrogen | 15504-020 | |
| Sodium Chloride(NaCl) | Sigma-Aldrich | S7653-5 kg | |
| Magnesium Chloride (MgCl2) | Sigma-Aldrich | M8266-100g | |
| dithioerythritol (DTE) | Sigma-Aldrich | B8255-5g | |
| ethanol (EtOH) | Sigma-Aldrich | 792780 | |
| tryptone | Amresco | J859-500g | |
| yeast extract | Fluka | 70161-500g | |
| Bacto agar | BD | 214010 | |
| ampicillin | Sigma-Aldrich | A9393-5g | |
| Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium (DMEM) | Corning | 10-013-CV | |
| phosphate-buffered saline (PBS) | Corning | 21-031-CV | |
| 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid (HEPES) | Sigma-Aldrich | H3375 | |
| puromycin | Sigma-Aldrich | P9620 | |
| Doxycycline hyclate | Sigma-Aldrich | D9891-25g | |
| Roswell Park Memorial Institute (RPMI) | Corning | 10-040-CV | |
| 0.5 M EDTA pH 8.0 | Thermo Fisher Scientific | R1021 | |
| Falcon Permeable Support for 24 Well Plate with 8.0μm Transparent PET Membrane | Becton Dickinson | 353097 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma-Aldrich | A7906 | |
| Cotton-Tipped Applicator | Medline | MDS202000 | |
| Protocol Hema 3 STAT pack | Fisher Scientific Company | 123-869 | |
| Resolve Immersion Oil, High Viscosity | Richard Allan Scientific | M4004 | |
| Penicillin Streptomycin | Gibco | 15140122 |
Referências
- Ryding, A. D., Sharp, M. G., Mullins, J. J. Conditional transgenic technologies. J Endocrinol. 171 (1), 1-14 (2001).
- Mantovani, A., Marchesi, F., Malesci, A., Laghi, L., Allavena, P. Tumour-associated macrophages as treatment targets in oncology. Nat Rev Clin Oncol. , (2017).
- Franklin, R. A., et al. The cellular and molecular origin of tumor-associated macrophages. Science. 344 (6186), 921-925 (2014).
- Ruffell, B., Coussens, L. M. Macrophages and therapeutic resistance in cancer. Cancer Cell. 27 (4), 462-472 (2015).
- Sharma, P., Allison, J. P. The future of immune checkpoint therapy. Science. 348 (6230), 56-61 (2015).
- Mizuguchi, H., Hayakawa, T. Characteristics of adenovirus-mediated tetracycline-controllable expression system. Biochim Biophys Acta. 1568 (1), 21-29 (2001).
- Meyer-Ficca, M. L., et al. Comparative analysis of inducible expression systems in transient transfection studies. Anal Biochem. 334 (1), 9-19 (2004).
- Wiederschain, D., et al. Single-vector inducible lentiviral RNAi system for oncology target validation. Cell Cycle. 8 (3), 498-504 (2009).
- Wee, S., et al. PTEN-deficient cancers depend on PIK3CB. Proc Natl Acad Sci U S A. 105 (35), 13057-13062 (2008).
- Chen, Y., Stamatoyannopoulos, G., Song, C. Z. Down-regulation of CXCR4 by inducible small interfering RNA inhibits breast cancer cell invasion in vitro. Cancer Res. 63 (16), 4801-4804 (2003).
- Wiznerowicz, M., Trono, D. Conditional suppression of cellular genes: lentivirus vector-mediated drug-inducible RNA interference. J Virol. 77 (16), 8957-8961 (2003).
- Solari, V., et al. MYCN-dependent expression of sulfatase-2 regulates neuroblastoma cell survival. Cancer Res. 74 (21), 5999-6009 (2014).
- Liao, Y., Tang, L. Inducible RNAi system and its application in novel therapeutics. Crit Rev Biotechnol. 36 (4), 630-638 (2016).
- Chen, H. C. Boyden chamber assay. Methods Mol Biol. 294, 15-22 (2005).
- Jungi, T. W. Assay of chemotaxis by a reversible Boyden chamber eliminating cell detachment. Int Arch Allergy Appl Immunol. 48 (3), 341-352 (1975).
- Jung, H. S., et al. Monoclonal antibodies against autocrine motility factor suppress gastric cancer. Oncol Lett. 13 (6), 4925-4932 (2017).
- Park, H., et al. Effect of Sorbus commixta on the invasion and migration of human hepatocellular carcinoma Hep3B cells. Int J Mol Med. , (2017).
- Schildberger, A., Rossmanith, E., Eichhorn, T., Strassl, K., Weber, V. Monocytes, peripheral blood mononuclear cells, and THP-1 cells exhibit different cytokine expression patterns following stimulation with lipopolysaccharide. Mediators Inflamm. 2013, 697972 (2013).
- Heil, T. L., Volkmann, K. R., Wataha, J. C., Lockwood, P. E. Human peripheral blood monocytes versus THP-1 monocytes for in vitro biocompatibility testing of dental material components. J Oral Rehabil. 29 (5), 401-407 (2002).
- Tsuchiya, S., et al. Establishment and characterization of a human acute monocytic leukemia cell line (THP-1). Int J Cancer. 26 (2), 171-176 (1980).
- de Almeida, M. C., Silva, A. C., Barral, A., Barral Netto, M. A simple method for human peripheral blood monocyte isolation. Mem Inst Oswaldo Cruz. 95 (2), 221-223 (2000).
- Flo, R. W., et al. Negative selection of human monocytes using magnetic particles covered by anti-lymphocyte antibodies. J Immunol Methods. 137 (1), 89-94 (1991).
- Grondahl-Hansen, J., et al. Plasminogen activator inhibitor type 1 in cytosolic tumor extracts predicts prognosis in low-risk breast cancer patients. Clin Cancer Res. 3 (2), 233-239 (1997).
- Borgfeldt, C., Hansson, S. R., Gustavsson, B., Masback, A., Casslen, B. Dedifferentiation of serous ovarian cancer from cystic to solid tumors is associated with increased expression of mRNA for urokinase plasminogen activator (uPA), its receptor (uPAR) and its inhibitor (PAI-1). Int J Cancer. 92 (4), 497-502 (2001).
- Devy, L., et al. The pro- or antiangiogenic effect of plasminogen activator inhibitor 1 is dose dependent. FASEB J. 16 (2), 147-154 (2002).
- Bajou, K., et al. Plasminogen activator inhibitor-1 protects endothelial cells from FasL-mediated apoptosis. Cancer Cell. 14 (4), 324-334 (2008).
- Xu, X., Wang, H., Wang, Z., Xiao, W. Plasminogen activator inhibitor-1 promotes inflammatory process induced by cigarette smoke extraction or lipopolysaccharides in alveolar epithelial cells. Exp Lung Res. 35 (9), 795-805 (2009).
- Ji, Y., et al. Pharmacological Targeting of Plasminogen Activator Inhibitor-1 Decreases Vascular Smooth Muscle Cell Migration and Neointima Formation. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 36 (11), 2167-2175 (2016).
- Carmeliet, P., et al. Inhibitory role of plasminogen activator inhibitor-1 in arterial wound healing and neointima formation: a gene targeting and gene transfer study in mice. Circulation. 96 (9), 3180-3191 (1997).
- Cao, C., et al. Endocytic receptor LRP together with tPA and PAI-1 coordinates Mac-1-dependent macrophage migration. EMBO J. 25 (9), 1860-1870 (2006).
- Thapa, B., Koo, B. H., Kim, Y. H., Kwon, H. J., Kim, D. S. Plasminogen activator inhibitor-1 regulates infiltration of macrophages into melanoma via phosphorylation of FAK-Tyr(9)(2)(5). Biochem Biophys Res Commun. 450 (4), 1696-1701 (2014).
- Kortlever, R. M., Higgins, P. J., Bernards, R. Plasminogen activator inhibitor-1 is a critical downstream target of p53 in the induction of replicative senescence. Nat Cell Biol. 8 (8), 877-884 (2006).
- Fang, H., Placencio, V. R., DeClerck, Y. A. Protumorigenic activity of plasminogen activator inhibitor-1 through an antiapoptotic function. J Natl Cancer Inst. 104 (19), 1470-1484 (2012).
- Bennett, S., Breit, S. N. Variables in the isolation and culture of human monocytes that are of particular relevance to studies of HIV. J Leukoc Biol. 56 (3), 236-240 (1994).
- Geissmann, F., et al. Development of monocytes, macrophages, and dendritic cells. Science. 327 (5966), 656-661 (2010).
- Bauer, M., Goldstein, M., Heylmann, D., Kaina, B. Human monocytes undergo excessive apoptosis following temozolomide activating the ATM/ATR pathway while dendritic cells and macrophages are resistant. PLoS One. 7 (6), e39956 (2012).
