इस प्रकाशन transendothelial विद्युत प्रतिरोध (तीळ) के प्रत्यक्ष ठहराव के लिए एकीकृत इलेक्ट्रोड के साथ एक अंग पर चिप डिवाइस के निर्माण का वर्णन करता है. सत्यापन के लिए, रक्त मस्तिष्क बाधा इस microfluidic डिवाइस के अंदर नकल उतारा गया था और उसके बैरियर समारोह पर नजर रखी गई । इलेक्ट्रोड एकीकरण और प्रत्यक्ष तीळ ठहराव के लिए प्रस्तुत विधियाँ सामान्यतः लागू होती हैं.
अंगों पर चिप्स, इन विट्रो में microfluidic उपकरणों के अंदर (मानव) ऊतकों की संस्कृति को शामिल मॉडल, तेजी से उभर रहे हैं और मानव स्वास्थ्य और रोग का अध्ययन करने के लिए उपयोगी अनुसंधान उपकरण प्रदान करने के लिए वादा करता हूँ. कोशिका परतों के बैरियर समारोह अंग-पर-चिप उपकरणों के अंदर प्रसंस्कृत विशेषताएं, अक्सर transendothelial या transepithelial विद्युत प्रतिरोध (तीळ) मापा जाता है । इस अंत करने के लिए, इलेक्ट्रोड आमतौर पर चिप में एकीकृत कर रहे हैं micromachining तरीकों से और अधिक स्थिर माप प्रदान करने के लिए की तुलना में इलेक्ट्रोड के मैनुअल प्रविष्टि के साथ प्राप्त की है चिप की सुविधा देता है. हालांकि, इन इलेक्ट्रोड अक्सर अध्ययन कक्ष परत के दृश्य निरीक्षण में बाधा या निर्माण के लिए महंगी cleanroom प्रक्रियाओं की आवश्यकता होती है । इन सीमाओं को दूर करने के लिए, उपकरण यहां वर्णित चार आसानी से एकीकृत इलेक्ट्रोड है कि रखा और संस्कृति क्षेत्र के बाहर तय कर रहे हैं, दृश्य संभव निरीक्षण कर रहे हैं । इन चार इलेक्ट्रोड का उपयोग करने से छः माप पथों का प्रतिरोध मात्रा जा सकता है, जिसमें से तीळ सीधे पृथक, संस्कृति माध्यम-भरे microchannels के प्रतिरोध से स्वतंत्र हो सकता है. इस डिवाइस में ब्लड-ब्रेन बैरियर की प्रतिकृति बनाई गई थी और डिवाइस को प्रयोज्यता दिखाने के लिए इसकी तीळ नजर आई । इस चिप, एकीकृत इलेक्ट्रोड और तीळ निर्धारण विधि आम तौर पर अंगों में लागू कर रहे हैं-पर-चिप्स, दोनों अन्य अंगों की नकल करने के लिए या मौजूदा अंग में शामिल किया जा करने के लिए-on-चिप सिस्टम.
अंगों पर चिप्स तेजी से एक नए और होनहार के वर्ग के रूप में उभर रहे हैं इन विट्रो ऊतक मॉडल । 1 इन मॉडलों में, कोशिकाओं microfluidic उपकरणों है कि इस तरह से है कि वे उन कोशिकाओं के शारीरिक microenvironment नकल में इंजीनियर है अंदर कल्चरित रहे हैं । 1 , 2 अधिक यथार्थवादी शारीरिक या उन कोशिकाओं की बीमारी व्यवहार में परिणाम से पारंपरिक सरल डिजाइन और बुनियादी समारोह के इन विट्रो मॉडल में से उंमीद की जा सकती है । 3 , 5 , 6 इसके अलावा, अंगों पर चिप्स vivo मॉडल में से एक बेहतर नियंत्रणीय वातावरण प्रदान करते हैं और दोनों मानव शरीर क्रिया विज्ञान और विकृति को दोहराने के लिए मानव मूल से स्वस्थ और रोगग्रस्त ऊतक दोनों को शामिल कर सकते हैं. हाल ही में रक्त-चिप्स (BBBs-on-चिप्स) पर मस्तिष्क बाधाओं के विकास में संक्षेप अग्रिम बताते है कि क्षेत्र जल्दी आगे बढ़ रहा है । 7
अंगों का एक और लाभ-पर-चिप्स है कि वे वास्तविक समय और सूक्ष्म, पर लाइन जैव रासायनिक विश्लेषण और एकीकृत सेंसर द्वारा डिवाइस के अंदर कल्चरित ऊतक के सतत निगरानी सक्षम है । 1 , 2 उदाहरण के लिए, transendothelial या transepithelial विद्युत प्रतिरोध (तीळ) को मापने गैर इनवेसिव विकास और बाधा के गठन के ऊतकों के विघटन की निगरानी के लिए एक शक्तिशाली तरीका है । 8 , 9 , 10 तीळ एक सेलुलर बाधा भर में विद्युत प्रतिरोध है और इसलिए बाधा अखंडता और पारगम्यता का संकेत है. 10 अंगों में-on-चिप्स, सेलुलर बाधाओं आम तौर पर एक झिल्ली है कि दो द्रवित चैनलों अलग, शिखर और उस बाधा ऊतक के basolateral डिब्बों का प्रतिनिधित्व करने पर संस्कृति रहे हैं । ऐसे चिप्स में, तीळ माप सुविधा देता है और दो चैनलों के आउटलेट में डाला इलेक्ट्रोड के साथ आसानी से आयोजित किया जा सकता है । 3 , 4 , 11 , 12 , 13 , 14 , 15 हालांकि, मैनुअल सम्मिलन और इलेक्ट्रोड का पुन संमिलन आसानी से प्लेसमेंट त्रुटियों में परिणाम कर सकते हैं और इस प्रकार के रूप में मापा प्रतिरोध में भिन्नता में उदा microchannels के माध्यम से अब या छोटे रास्तों के प्रतिरोध में मतभेद कोशिका बाधा प्रतिरोध की तुलना में महत्वपूर्ण हैं । 16 फिर से inserting त्रुटियों को समाप्त करने के लिए, एकीकृत इलेक्ट्रोड के साथ उपकरणों का प्रस्ताव किया गया है । हालांकि, इन एकीकृत इलेक्ट्रोड के अधिकांश देखने ब्लॉक जब ऊतक संस्कृति17,18,19,20,21 और/ निर्माण के लिए cleanroom प्रक्रियाओं । 17 , 22
इस प्रकाशन में वर्णित अंग-पर-चिप डिवाइस, पहले एक प्रकाशन में लागू,16 मापा सेल परत और आसान निर्माण पर दृश्यता के साथ एकीकृत इलेक्ट्रोड की स्थिरता को जोड़ती है । इस चिप के डिजाइन और निर्माण चित्रा 1में दिखाया गया है । संक्षेप में, इस उपकरण के साथ दो polydimethylsiloxane (PDMS) भागों चैनल प्रिंट कि एक साथ रिसाव से मुक्त ०.४ µm pores के बीच में एक पाली कार्बोनेट झिल्ली के साथ बंधुआ रहे है के होते हैं । चार प्लैटिनम तार इलेक्ट्रोड डाला और एक photocurable अच्छी तरह से संस्कृति क्षेत्र के बाहर चिपकने के साथ जगह में तय कर रहे हैं । इन निर्माण कदम के सभी सामांय प्रयोगशाला उपकरण के साथ आयोजित किया जा सकता है, एक cleanroom पर्यावरण की आवश्यकता के बिना । इस के शीर्ष पर, छह प्रतिबाधा माप इन चार इलेक्ट्रोड का उपयोग किया जा सकता है, जिससे मापा तीळ के प्रत्यक्ष अलगाव, क्रॉस सेक्शन तक अग्रणी microchannels के प्रतिरोध से स्वतंत्र और इस प्रकार के प्रभाव को कम करने की अनुमति सिस्टम में गैर-जैविक भिंनताएं जैसे (re) सम्मिलन त्रुटि । 16
इस यन्त्र की प्रयोज्यता और प्रत्यक्ष तीळ माप को दिखाने के लिए इस चिप में रक्त-मस्तिष्क बाधा (BBB) की प्रतिकृति बनाई गई. इस जैविक बाधा विशेष endothelial कोशिकाओं के होते है और मस्तिष्क homeostasis प्रदान करने के लिए रक्त और मस्तिष्क के बीच परिवहन नियंत्रित करता है । 23 , 24 BBB की नकल करने के लिए, microfluidic डिवाइस के शीर्ष चैनल hCMEC/D3 सेल लाइन से मानव मस्तिष्क microvascular endothelial कोशिकाओं के साथ लाइन में खड़ा किया गया था (कृपया द्वारा प्रदान की डॉ. पी.-ओ. Couraud, INSERM, पेरिस, फ्रांस) । 25 प्रस्तुत विधि है, तथापि, और अधिक आम तौर पर किसी भी अंग के लिए लागू-पर चिप डिवाइस दो डिब्बों के साथ, प्रत्यक्ष तीळ आसानी से एकीकृत इलेक्ट्रोड का उपयोग कर निर्धारण को सक्षम करने.
इस पांडुलिपि में, पहले एकीकृत इलेक्ट्रोड के साथ अंग-पर-चिप डिवाइस के निर्माण की प्रक्रिया का वर्णन किया गया है । अगला, सीडिंग प्रक्रिया और डिवाइस के अंदर मस्तिष्क endothelial कोशिकाओं की संस्कृति को समझाया है, साथ ही ऑन-चिप तीळ माप. परिणाम अनुभाग में, प्रतिनिधि तीळ माप दिखाया जाता है और डेटा प्रोसेसिंग स्पष्ट किया जाता है । अंत में, BBB के बैरियर समारोह-पर चिप, 3 दिनों के दौरान निगरानी, प्रस्तुत डिवाइस और तरीकों की प्रयोज्यता दिखा रहा है पर नजर रखने के लिए तीळ ।
1. अंग का निर्माण-पर-चिप डिवाइस चैनल डिजाइन, मानक photolithography तकनीकों का उपयोग कर गढ़े के साथ एक मोल्ड की एक PDMS प्रतिकृति बनाने के लिए, और PDMS चिप के microfluidic भागों प्राप्त करते हैं । लगभग 27 ग्राम PDMS आधार एजेंट और २.७ g इलाज एजेंट का वजन; जन अनुपात को 10:1 करने की जरूरत है । यह १३० मिमी (5 इंच) व्यास के साथ एक मोल्ड पर एक 3 मिमी मोटी PDMS स्लैब के लिए अच्छा है । इन घटकों को अच्छी तरह मिलाएं । Degas लगभग ४५ मिनट के लिए एक desiccator में मिश्रण हवा के बुलबुले को दूर करने के लिए । इस बीच, मोल्ड के चारों ओर स्पष्ट टेप चिपके हुए या एक उपयुक्त वेफर धारक में मोल्ड जगह तरल PDMS मिश्रण के लिए मोल्ड तैयार करते हैं । मोल्ड पर degassed PDMS मिश्रण डालो । किसी भी हवा के बुलबुले PDMS मिश्रण में या मोल्ड सतह पर बने हुए हैं, तो यह लगभग 30 मिनट के लिए फिर से degas. एक ओवन में PDMS मिश्रण का ईलाज ६० & #176; ग के लिए 4 ज. शांत करने के लिए अनुमति दें । एक पार प्रवाह डाकू में , मोल्ड से ठीक PDMS खींचो; मोल्ड को तुरंत अधिक PDMS replicas बनाने के लिए पुनः उपयोग किया जा सकता है । PDMS. में लाइनों काटने का उपयोग कर अलग शीर्ष और नीचे चिप भागों में PDMS प्रतिकृति काट पंच और दुकानों के फार्म के लिए 1 मिमी व्यास के साथ एक तेज बायोप्सी पंच का उपयोग कर शीर्ष भागों में चार छेद । अंदर से बाहर पंच को चिप में इकट्ठा करने से PDMS मलबे को रोकने के लिए । उंहें धूल के खिलाफ की रक्षा के लिए स्पष्ट टेप के साथ चिप भागों को कवर । लगभग 3 & #215 के वर्गों में Transwell आवेषण से कट पाली कार्बोनेट झिल्ली; 3 मिमी 2 . एक छिद्रित झिल्ली रिसाव-मुक्त दो PDMS भागों के बीच में आदेश में एक दो परत एक छिद्रित झिल्ली के साथ इंटरफेस इकट्ठा करने के लिए इकट्ठा । नोट: इस प्रोटोकॉल Griep एट अल से अनुकूलित है । १९ आणि Chueh एट अल . २६ PDMS आधार एजेंट के ०.७ g का उपयोग कर एक टोल्यूनि/PDMS मोर्टार तैयार करें, ०.०७ g इलाज एजेंट और ५४० & #181; L का टोल्यूनि, जिसके परिणामस्वरूप 5:3 भार अनुपात में । भंवर अच्छी तरह से मोर्टार । स्पिन-कोट २०० & #181; एक गिलास coverslip पर मोर्टार के एल ६० के लिए १५०० rpm पर (१००० rpm/एस पर रैंप पर) एक पतली, मोर्टार की वर्दी परत प्राप्त करने के लिए । coverslip से एक नीचे भाग पर और एक स्याही रोलर के साथ चिप के एक शीर्ष भाग पर मोर्टार की एक पतली परत हस्तांतरण । एक ओवन सुरक्षित पकवान में नीचे भाग रखो । चिमटी का एक सेट के साथ , स्पिन लेपित मोर्टार में एक झिल्ली के किनारों डुबकी और यह ध्यान से नीचे भाग के बीच में जगह है । ध्यान से संरेखण के लिए भुगतान करते हुए नीचे भाग पर शीर्ष भाग जगह है । नोट: चिप पर दबाव नहीं डालती है और नीचे भाग पर शीर्ष हिस्सा स्लाइड नहीं चैनलों में प्रवेश करने से मोर्टार को रोकने के लिए और झिल्ली कॉलेस्ट्रॉल । चिप में प्रवेश करने से धूल को रोकने और ६० & #176 पर सेंकना करने के लिए स्पष्ट टेप के साथ चिप्स को कवर कर सकते हैं, 3 एच के लिए सी साइड चैनलों में इलेक्ट्रोड को एकीकृत. नोट: इस प्रोटोकॉल Griep एट अल से अनुकूलित है । १९ आणि Douville एट अल . १८ के टुकड़ों में प्लैटिनम तार काट लगभग 2 सेमी. साफ उंहें एसीटोन में विलय के लिए 30 मिनट के लिए पानी और इथेनॉल के साथ कुल्ला और सूखी अनुमति देते हैं । एक पार प्रवाह डाकू में , एक प्लास्टिक की डिश पर एक चिप डाल दिया । एक चिप के इलेक्ट्रोड चैनलों में चार प्लेटिनम तारों को डालें चिमटी की एक जोड़ी का उपयोग कर और उंहें नीचे प्लास्टिक पकवान पर मोड़ को एक बाद में कदम में पकवान को निर्धारण सक्षम । टी के आकार चैनल जंक्शन पिछले, संस्कृति चैनल में 0.7-1 मिमी तारों डालें. इलेक्ट्रोड चैनल प्रवेश द्वार पर यूवी का इलाज गोंद की एक बूंद लागू करते हैं और गोंद केशिका बलों द्वारा इलेक्ट्रोड के आसपास चैनल को भरने के लिए अनुमति देते हैं । यूवी पर स्विच और गोंद का इलाज जब यह इलेक्ट्रोड चैनल के अंत तक पहुँच जाता है. सावधानी: यह तुंहारी आंखों को नुकसान पहुंचा सकता है के रूप में यूवी प्रकाश स्रोत में मत देखो । एक दो घटक epoxy चिपकने के साथ प्लास्टिक डिश के लिए चार एकीकृत इलेक्ट्रोड निर्धारण । इस चिप से इलेक्ट्रोड खींच के जोखिम के बिना माप के दौरान इलेक्ट्रोड की आसान हैंडलिंग की अनुमति देता है. स्पष्ट टेप के साथ चिप्स कवर और उंहें ६० & #176 पर सेंकना 2 एच के लिए सी के लिए नीचे ठंडा और दुकान धूल मुक्त उपयोग जब तक की अनुमति दें । इस तरह वे सुरक्षित रूप से एक महीने के लिए संग्रहीत किया जा सकता है ।
2. मस्तिष्क-व्युत्पंन endothelial कोशिकाओं पर चिप संस्कृति कोट चिप्स सेल लगाव को बढ़ावा देने के लिए । फॉस्फेट बफर खारा (पंजाब) के साथ दोनों चैनलों उन्हें रिएजेंट शुरू करने से पहले गीला करने के लिए भरें । एक खुर्दबीन के नीचे की जाँच करें अगर वहाँ चैनलों में किसी भी हवा के बुलबुले हैं । यदि हां, तो उंहें अतिरिक्त पंजाबियों के साथ फ्लश करके निकालें । के दोनों चैनलों को भरें 30 & #181; L के 20 & #181; छ/एमएल मानव fibronectin में पंजाब । ३७ & #176 पर मशीन 3 घंटे के लिए सी । हवा के बुलबुले के लिए जाँच करें और, अगर जरूरत है, पंजाबियों के साथ चैनलों फ्लश और fibronectin समाधान के साथ फिर से भरना । endothelial विकास के माध्यम से चिप्स फ्लश और उंहें ३७ & #176 पर मशीन; सी और 5% सह 2 एच. के लिए एक मशीन में दो चरण 3 में वर्णित के रूप में रिक्त चिप्स के तीळ को मापने के लिए सुनिश्चित करें कि इलेक्ट्रोड के सभी चैनलों में तरल पदार्थ के साथ सीधे संपर्क में हैं. खाली चिप्स, टिपिकल तीळ मान 0-1 & #8486; सेमी 2 . बीज कोशिकाओं को शीर्ष चैनल में । कल्चरल मीडियम को कल्चरल कुप्पी (७५ सेमी 2 कल्चरल एरिया) से हटा कर मानव सेरेब्रल monolayer microvascular कोशिकाओं (endothelial/D3) के एक धाराप्रवाह hCMEC के साथ. पंजाबियों के साथ कोशिकाओं को धो लें । ०.०५% trypsin-EDTA और मशीन के 2 मिलीलीटर जोड़ें ३७ & #176; सी और 5% कं 2 2-5 मिनट तक के लिए जब तक कोशिकाओं संस्कृति कुप्पी से अलग है । 20% भ्रूण गोजातीय सीरम (FBS) के साथ पूरक संस्कृति माध्यम के साथ trypsin को निष्क्रिय । कक्षों को गिनना और निलंबन में कक्षों की कुल संख्या की गणना करें. इस बीच, hCMEC/D3 कक्षों में ३९० x g 5 मिनट के लिए और निकालें supernatant. endothelial विकास मध्यम (ईजीएम-2) के उपयुक्त मात्रा में सेल गोली reसस्पैंड 5 x 10 6 कोशिकाओं की एकाग्रता पर पहुंचने के लिए/ इस चिप में 2 x 10 5 कोशिकाओं/सेमी 2 के एक बीज का घनत्व में यह परिणाम है । धीरे पिपेट 30 & #181; एल की अच्छी तरह से मिश्रित सेल निलंबन शीर्ष चैनल में और एक धाराप्रवाह गति में प्रवेश से पिपेट को दूर करते हुए अभी भी दबाव डालती । एक खुर्दबीन के नीचे बीज घनत्व की जांच करें । शीर्ष चैनल भर में कोशिकाओं का एक समान वितरण प्राप्त किया जाना चाहिए । पर चिप्स ३७ & #176; ग और 5% कं 2 के लिए कम से 1 ज. endothelial संस्कृति माध्यम के साथ किसी भी गैर संलग्न कोशिकाओं बाहर फ्लश. मेन्टेन ऑन-चिप endothelial कल्चर. दो बार प्रति दिन, डालने संस्कृति मध्यम-लेट्स में जलाशयों के रूप में पिपेट सुझावों भरा और गुरुत्वाकर्षण चालित प्रवाह द्वारा चिप के अंदर माध्यम की जगह । नोट: microchannels में प्रवेश करने और कोशिका परत को नष्ट करने से हवा के बुलबुले से बचने के लिए, एक प्रवेश में टिप डालने से पहले पिपेट टिप और चिप के शीर्ष पर तरल पदार्थ के बीच तरल पदार्थ संपर्क बनाने के लिए सुनिश्चित करें. इस में/आउटलेट से पहले पिपेट प्रविष्टि में एक छोटी सी बूंद जोड़कर सुविधा हो सकती है । भी दुकानों में पिपेट टिप जलाशयों जोड़ने के लिए चैनलों को सुखाने से रोकने के लिए । पर चिप्स ३७ & #176; ग र 5% सह 2 .
3. ऑन-चिप तीळ माप सेट अप गुई तीळ माप तंत्र, एक लॉक-एम्पलीफायर में शामिल है और एक जांच केबल सर्किट के रूप में वान डेर पतवार एट अल में निर्दिष्ट किया गया था । १६ वैकल्पिक रूप से, potentiostats या प्रतिबाधा विश्लेषक भी इन प्रतिबाधा आधारित तीळ माप के लिए उपयुक्त हैं. मशीन से चिप ले लो और यह कमरे के तापमान तक पहुंचने के लिए अनुमति देने के लिए ंयूनतम 10 मिनट । इलेक्ट्रोड के आसपास प्लास्टिक डिश से किसी भी द्रव निकालें इलेक्ट्रोड चिप के बाहर ब्रिजिंग को रोकने के लिए. २०० हर्ट्ज से प्रतिबाधा स्पेक्ट्रम ले दो इलेक्ट्रोड के प्रत्येक संयोजन के लिए 1 मेगाहर्ट्ज, केवल 5-10 मिनट में प्रति चिप 6 प्रतिबाधा स्पेक्ट्रा में जिसके परिणामस्वरूप. प्रतिबाधा स्पेक्ट्रा की उम्मीद परिमाणों और तीळ माप को मान्य करने के लिए आकार है, तो जाँच करें परिणाम अनुभाग में वर्णित है. मशीन में वापस चिप डाल ३७ & #176; ग और 5% कं 2 माप खत्म करने के बाद । एक सामान्यीकृत तीळ मूल्य पर आने के लिए प्राप्त प्रतिबाधा स्पेक्ट्रा प्रक्रिया. मापा प्रतिरोध प्राप्त करें इलेक्ट्रोड के बीच और , चित्रा 2 बी और डी , प्रतिरोधक पठार से 10 kHz इसी प्रतिबाधा स्पेक्ट्रा में. की गणना करें तीळ का उपयोग कर छह मापा resistances एक समय बिंदु पर एक चिप के लिए संगत चित्रा 2g 16 : इस समीकरण में, वह कल्चर क्षेत्र है जिसके माध्यम से प्रतिरोध मापा गया था, सेलुलर बाधा और झिल्ली का प्रतिरोध है, , , और प्रतिरोध हैं सेलुलर बाधा के माध्यम से मापा मान और और में मापा प्रतिरोध मान हैं सीधे चैनल । १६ समीकरण के समकक्ष सर्किट से ली गई है चित्रा 2c . समय में तीळ के विकास को प्राप्त करने के लिए सभी समय बिंदुओं पर तीळ से कोरा तीळ घटाना.
इस पांडुलिपि में एक अंग-पर-चिप डिवाइस की इंजीनियरिंग और एक सेलुलर बैरियर के transendothelial विद्युत प्रतिरोध (तीळ) का प्रत्यक्ष निर्धारण इस उपकरण में कल्चरल प्रस्तुत किया गया. cleanroom उपकरण और चार इलेक्ट्रोड का उपयोग कर प्रत्यक्ष तीळ संकल्प के बिना इलेक्ट्रोड को एकीकृत करने के प्रस्तुत विधि दो microfluidic डिब्बों के साथ किसी भी अंग-पर-चिप डिवाइस के लिए लागू है. चिप लेआउट और ज्यामिति अनुरूप प्रयोगों की आवश्यकताओं को फिट करने के लिए अनुकूलित किया जा सकता है, जब तक चार इलेक्ट्रोड दो डिब्बों में अलग कर रहे हैं. चार इलेक्ट्रोड भी सुविधा मौजूदा चिप्स की सुविधा में डाला जा सकता है, बशर्ते कि वे छह माप की अवधि के लिए जगह में निर्धारण कर रहे हैं. रिसाव से मुक्त बांडिंग विधि अलग झिल्ली और चैनल geometries के लिए PDMS/टोल्यूनि अनुपात को बदलकर अनुकूलित किया जा सकता है । एक उच्च टोल्यूनि सामग्री के एक पतले स्पिन-लेपित परत के मोर्टार26 में परिणाम और PDMS भागों में और अधिक आमूलचूल और संकरा चैनल के लिए अधिक उपयुक्त हो सकता है । एक कम टोल्यूनि सामग्री एक मोटा मोर्टार परत26 में परिणाम और अधिक PDMS भागों के बीच मोटा झिल्ली संलग्न करने के लिए उपयुक्त हो सकता है ।
के रूप में चित्रा 2a और प्रयोगात्मक स्पेक्ट्रा में चित्रा 2E और 2Fमें योजनाबद्ध प्रतिबाधा स्पेक्ट्रा में देखा जा सकता है, प्रतिबाधा माप इलेक्ट्रोड माध्यम अंतरफलक पर डबल परत समाई से प्रभावित कर रहे हैं. microchannels के अंदर इलेक्ट्रोड के छोटे आकार के कारण, डबल परत समाई प्रतिबाधा स्पेक्ट्रा में सेलुलर बैरियर के प्रतिरोधक पठार पर हावी हो सकते हैं, तीळ की ठहराव उलझी हुई. इसे दूर करने के लिए, इलेक्ट्रोड निर्धारण से पहले संस्कृति चैनल में आगे डाला जा सकता है. इस संस्कृति के माध्यम से अवगत कराया इलेक्ट्रोड की सतह क्षेत्र में वृद्धि होगी और साथ कि डबल परत समाई के रूप में अच्छी तरह से वृद्धि होगी. यह कम आवृत्तियों के लिए समाई ढलान की एक पारी में परिणाम है, ताकि सेलुलर बाधा के प्रतिरोधक पठार और अधिक आसानी से पहचाना जा सकता है और मात्रा. हालांकि दो इलेक्ट्रोड के बीच मापा पथ के प्रतिरोध छोटे हो जाएगा, इस प्रस्तुत विधि निम्नलिखित तीळ ठहराव को प्रभावित नहीं करेगा.
जबकि सेलुलर बाधा के माध्यम से मापने, यह संभव है कि अतिरिक्त प्रतिरोधक पठार मांयता प्राप्त नहीं किया जा सकता है । यह दो चैनलों के बीच एक द्रव कनेक्शन का परिणाम हो सकता है, उदाहरण के लिए अगर झिल्ली खराब मोर्टार से घिरा हुआ है, सेलुलर बाधा के आसपास एक मापा पथ के लिए अग्रणी । इलेक्ट्रोड संस्कृति माध्यम की एक छोटी बूंद से जुड़े हुए हैं अगर इसके अलावा, वहाँ चिप के बाहर बिजली पाटने हो सकता है. यह आम तौर पर एक कम मापा प्रतिबाधा के साथ संयुक्त है और संस्कृति माध्यम के इस पुल को हटाने के द्वारा हल किया जा सकता है. अंत में, अगर कोई प्रतिरोधक पठार है और मापा प्रतिबाधा उच्च परिमाण के आदेश से उम्मीद की जाती है, वहाँ बिजली के तारों में एक ढीला कनेक्शन या शक्ति के स्रोत पर हो सकता है.
भविष्य में, वर्तमान BBB की शारीरिक प्रासंगिकता-on-चिप शारीरिक स्तर, जो BBB भेदभाव और वृद्धि बाधा जकड़न को बढ़ावा देने के लिए सूचित किया है और प्राप्त करने के लिए मुश्किल में कतरनी तनाव को endothelial कोशिकाओं को प्रकाश में लाने के द्वारा बढ़ाया जा सकता है पारंपरिक इन विट्रो मॉडल में । 29 इसके अलावा, प्रस्तुत उपकरण के नीचे चैनल मस्तिष्क व्युत्पंन कोशिकाओं के लिए एक उपयुक्त डिब्बे को सह endothelium के साथ संस्कृति प्रदान करता है । यह भी बाधा समारोह में वृद्धि की उंमीद है और भी रोग की स्थिति में प्रासंगिक कोशिका प्रकार के बीच जटिल बातचीत के अध्ययन में सक्षम बनाता है । 29
अंत में, अंग पर चिप इस प्रकाशन में वर्णित उपकरण मानक प्रयोगशाला उपकरण का उपयोग कर गढ़े जा सकता है और प्रत्यक्ष तीळ का उपयोग कर माप प्रदान करने के लिए दिखाया गया है चार एकीकृत इलेक्ट्रोड कि अध्ययन कक्ष के दृश्य निरीक्षण में बाधा नहीं है परत. अंगों-पर-चिप्स क्षेत्र में इस उपकरण की प्रयोज्यता इस चिप में BBB नकल उतार द्वारा प्रदर्शन किया गया था और संस्कृति की अवधि के दौरान तीळ की निगरानी । अन्य (बैरियर) अंगों के एक मेजबान इस चिप में अन्य प्रासंगिक सेल प्रकार को शामिल करके नकल उतारा जा सकता है । इसके अलावा, तीळ को मापने के लिए विधि आसानी से अन्य दो डिब्बे आधारित अंग-पर-चिप उपकरणों में लागू किया जा सकता है प्रतिलिपि और सार्थक तीळ मूल्यों है कि उपकरणों और प्रणालियों के पार की तुलना में किया जा सकता है पर पहुंचने के लिए ।
The authors have nothing to disclose.
हम कृतज्ञता और डेटा प्रतिनिधित्व के साथ उपयोगी विचार विमर्श और सहायता के लिए मोल्ड और Mathijs Bronkhorst के निर्माण के लिए जोहन Bomer स्वीकार करते हैं ।
इस शोध के द्वारा वित्त पोषित किया गया था: सळो बायोमेडिकल Microdevices ऑफ L.I. Segerink, मीरा इंस्टिट्यूट फॉर बायोमेडिकल इंजीनियरिंग एंड टेक्निकल मेडिसिन, यूनिवर्सिटी ऑफ Twente; ईसवी वान डेर मी्र के सळो अंगों-पर-चिप्स, मीरा इंस्टिट्यूट फॉर बायोमेडिकल इंजीनियरिंग और टेक्निकल मेडिसिन, यूनिवर्सिटी ऑफ Twente; और VESCEL, ईआरसी को अ. वान मांद बर्ग (अनुदान सं. ६६९७६८) को नत अनुदान ।
Materials | |||
Polydimethylsiloxane (PDMS) base agent and curing agent: Sylgard 184 Silicone elastomer kit | Dow Corning | 1673921 | |
Scotch Magic tape | 3M | ||
Biopsy punch, 1.0 mm diameter | Integra Miltex | 33-31AA-P/25 | |
Polycarbonate membrane, 0.4 µm pore size | Corning | 3401 | Cut from Transwell culture inserts |
Toluene | Sigma-Aldrich | 244511 | |
Platinum wire, 200 µm diameter | Alfa Aesar | 10287 | |
UV-curable adhesive: Norland Optical Adhesive 81 | Norland Products | NOA 81 | |
Epoxy adhesive: Loctite M-31 CL Hysol | Henkel | 30673 | |
hCMEC/D3 cells | Human cerebral microvascular endothelial cell line, kindly provided by Dr. P.-O. Couraud, INSERM, Paris, France | ||
Phosphate buffered saline (PBS) | Sigma | P4417 | |
Human plasma fibronectin, 20 µg/ml | Gibco | 33016015 | |
Endothelial growth medium-2 (EGM-2) | Lonza | CC-3162 | Endothelial basal medium-2 (EBM-2) supplemented with EGM-2 SingleQuots |
Trypsin-EDTA, 0.05% | Gibco | 15400-054 | |
Fetal bovine serum (FBS) | Gibco | 26140-079 | |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Equipment | |||
Oven | Binder | 9010-0190 | |
Spin coater: Spin 150 | Polos | SPIN150-NPP | |
UV light source, 365 nm for 5 s at 350 mW/cm2 | Manufactured in-house | ||
Centrifuge: Allegra X-12R Centrifuge | Beckman Coulter | ||
Incubator | Binder | CB E2 150 | |
Boxense | LocSense | Lock-in amplifier with probe cable circuit, specialized for on-chip TEER measurements |