Denna publikation beskriver tillverkning av en orgel-on-chip-enhet med integrerad elektroder för direkt kvantifiering av transendothelial resistans (TEER). För validering, den blood – brain barriären var härmade inuti mikroflödessystem enheten och dess barriärfunktion övervakades. De presenteras metoderna för elektrod integration och direkta TEER kvantifiering är allmänt tillämpliga.
Organ-på-chips, in vitro- modeller som omfattar kultur (mänskliga) vävnader inuti mikroflödessystem enheter, är snabbt framväxande och löfte att tillhandahålla användbar forskning verktyg för att studera människors hälsa och sjukdom. För att karaktärisera barriärfunktionen av cell lager odlade inuti enheter orgel-on-chip, mäts ofta transendothelial eller transepithelial elektriskt motstånd (TEER). I detta syfte är elektroder vanligtvis integrerade i chip av micromachining metoder att ge stabilare mätningar än uppnås med manuell infogning av elektroder i öppningarna av chip. Dock dessa elektroder ofta försvårar visuell inspektion av det studera celllagrar eller kräver dyra renrum processer för tillverkning. För att övervinna dessa begränsningar, innehåller den enhet som beskrivs här fyra enkelt integrerad elektroder som är placerade och fast utanför kulturområdet, möjliggöra visuell inspektion. Använda dessa fyra elektroder motståndet av sex mätning sökvägar kan kvantifieras, varifrån TEER kan direkt isoleras, oberoende av motståndet av odlingsmedium-fyllda mikrokanaler. På blod – hjärnbarriären duplicerades i denna enhet och dess TEER var övervakas för att visa enheten tillämpligheten. Detta chip, integrerad elektroderna och TEER bestämning metoden är allmänt tillämpliga i organ-på-chips, både att efterlikna andra organ eller införlivas befintliga organ-på-chip system.
Organ-på-chips är snabbt växer fram som en ny och lovande klass av in vitro- vävnad modeller. 1 i dessa modeller, celler odlas inuti mikroflödessystem enheter som är konstruerad på ett sådant sätt att de härmar den fysiologiska mikromiljö av dessa celler. 1 , 2 detta resulterar i mer realistiska fysiologiska eller patologiska beteende av dessa celler än kan förväntas från konventionella in vitro- modeller av enkel design och grundläggande funktion. 3 , 5 , 6 dessutom organ-på-chips ger en bättre kontrollerbar miljö än i vivo modeller och kan införliva både frisk och sjuk vävnad från mänskligt ursprung att troget efterbilda både människans fysiologi och patologi. De nyligen summerade framsteg i utvecklingen av blod – hjärnan hinder på chips (BBBs-på-chips) visar att fältet är snabbt rör sig framåt. 7
En annan fördel med organ-på-chips är att de i realtid och kontinuerlig övervakning av vävnaden odlade inuti enheten genom mikroskopi, on-line biokemiska analyser och integrerade sensorer. 1 , 2 exempelvis mätning av transendothelial eller transepithelial elektriska resistans (TEER) är en kraftfull metod för att övervaka icke-invasivt utvecklingen och störningar av barriär-bildar vävnader. 8 , 9 , 10 TEER är det elektriska motståndet över en cellulär barriär och är därför vägledande barriär integritet och permeabilitet. 10 i organ-på-chips odlas allmänt cellulära hinder på ett membran som separerar två fluidic kanaler, som representerar den apikala och basolateral fack att barriären vävnad. I sådana marker, kan TEER mätningar utföras bekvämt med elektroder isatt i vikar och uttag av de två kanalerna. 3 , 4 , 11 , 12 , 13 , 14 , 15 dock manuell infogning och återinföring av elektroderna kan lätt resultera i placering fel och således i variationer i uppmätta motståndet som t.ex. skillnaderna i motståndet av längre eller kortare vägar genom mikrokanaler betydande är jämfört med cell barriär motståndet. 16 för att eliminera återinföring fel, enheter med integrerad elektroder har föreslagits. Men de flesta av dessa integrerade elektroder blockera vyn när inspekterar de vävnadsodling17,18,19,20,21 och/eller kräver specialiserade renrum processer för tillverkning. 17 , 22
Den orgel-on-chip-enhet som beskrivs i denna publikation, först tillämpas i en tidigare publikation,16 förenar stabiliteten för integrerad elektroder med synlighet på uppmätta cellager och lätt tillverkning. Design och tillverkning av detta chip avbildas i figur 1. Kort sagt, denna enhet består av två Polydimetylsiloxan (PDMS) delar med kanal avtryck som limmas ihop läckage-fri med polykarbonat membran med 0,4 µm porer i mellan. Fyra platina trådelektroder infogas och fast på plats med en photocurable självhäftande väl utanför kulturområdet. Alla stegen fabrication kan utföras med Allmän laboratorieutrustning, utan behov av renrum. Ovanpå detta, sex impedans mätningar kan göras med dessa fyra elektroder, vilket innebär att direkta isolering av den uppmätta TEER, oberoende av motståndet av den mikrokanaler leder upp till tvärsnittet och därmed minimera påverkan av icke-biologiska variationer i systemet såsom (åter) införande fel. 16
För att Visa tillämpligheten av denna enhet och de direkta TEER-mätningarna, duplicerades på blod – hjärnbarriären (BBB) i detta chip. Denna biologiska barriär består av specialiserade endotelceller och reglerar transporter mellan blod och hjärna att ge hjärnan homeostas. 23 , 24 för att efterlikna BBB, den övre kanalen i ultrakalla enheten var kantad av mänskliga cerebral mikrovaskulära endotelceller från hCMEC/D3 cell linje (vänligen tillhandahållen av Dr. P.-O. Couraud, INSERM, Paris, Frankrike). 25 den presenterade metoden är, men mer allmänt tillämpliga på alla organ-på-chip enheter med två fack, möjliggör direkt TEER bestämning använda enkelt integrerade elektroder.
I detta manuskript beskrivs först tillverkningsprocessen av organ-på-chip enheten med integrerad elektroder. Nästa, sådd förfarandet och kultur av hjärnan endothelial celler inuti enheten förklaras, liksom på chip TEER mätningarna. I resultatavsnittet visas representativa TEER mätningar och databehandling klargöras. Slutligen presenteras barriärfunktionen av BBB-på-chip, övervakas under 3 dagar, visar tillämpligheten av presenterade enheten och metoder för att övervaka TEER.
I detta manuskript presenterades konstruktion av en orgel-on-chip-enhet och direkt bestämning av transendothelial elektriska motstånd (TEER) en cellulär barriär som odlade i enheten. Den presenterade metoden att integrera elektroder utan renrum utrustning och direkta TEER bestämning med fyra elektroder är tillämplig på alla organ-på-chip enheter med två mikroflödessystem fack. Chip layout och geometri kan anpassas att passa kraven i de tänkt experiment, så länge som fyra elektroderna är separerade i två fack. De fyra elektroderna kan även infogas bekvämt i öppningarna på befintliga marker, förutsatt att de är fixerade på plats för varaktigheten av de sex mätningarna. Metoden läckage-fri bindning kan optimeras för olika membran och kanal geometrier genom att ändra förhållandet PDMS/toluen. En högre halt av toluen resulterar i ett tunnare spin-belagd lager av murbruk26 och kan vara mer lämplig för grundare och smalare kanaler i PDMS delar. En lägre toluen innehåll resulterar i en tjockare mortel lager26 och kan vara mer lämplig att omsluta tjockare membran mellan PDMS delar.
Som kan ses i Schematisk impedans spektra i figur 2A och de experimentella spektra i figur 2E och 2F, är impedans mätningarna influerade av den dubbla lager kapacitansen i elektrod-medium-gränssnittet. På grund av den lilla storleken på elektroderna inuti mikrokanaler, kan den dubbla lager kapacitansen dominera över resistiv platån av cellulära barriären i impedans spectra, komplicerande kvantifiering av TEER. För att övervinna detta, elektroderna kan införas längre in kultur kanalerna innan fixering. Detta kommer att öka ytan av elektroden utsatt till odlingsmediet och med det den dubbla lager kapacitansen ökar också. Detta resulterar i en förskjutning av kapacitiv lutningen till lägre frekvenser, så att den resistiva platån av cellulära barriär kan lättare igenkända och kvantifierade. Även om motståndet av den uppmätta sökvägen mellan två elektroder blir mindre, kommer detta inte att påverka TEER kvantifiering efter denna metod.
När du mäter genom cellulär barriären, är det möjligt att extra resistiv platån inte kan kännas igen. Detta kan vara resultatet av en fluidic anslutning mellan de två kanalerna, till exempel om membranet är dåligt omsluten av murbruk, leder till en uppmätt bana runt den cellulära barriären. Dessutom kan det elektriska överbrygga utanför chip om elektroderna är anslutna via en droplet som odlingssubstrat. Detta är ofta i kombination med en lägre uppmätta impedansen och kan lösas genom att ta bort denna bro som odlingssubstrat. Slutligen, om det finns ingen resistiv platå och den uppmätta impedansen är tiopotenser högre än väntat, det kan finnas en lös anslutning i den elektriska ledningar eller på strömkällan.
I framtiden, kan den fysiologiska betydelsen av det nuvarande BBB-on-chipet ökas genom att utsätta de endothelial cellerna om du vill skeva stress vid fysiologiska nivåer, vilket redovisas att främja BBB differentiering och öka barriär täthet och är svårt att uppnå i konventionella in vitro- modeller. 29 den nedre kanalen för presenterade enheten innehåller dessutom ett lämpligt fack för brain-derived celler för att tillsammans vara odlade med endotelet. Detta förväntas också öka barriärfunktionen och möjliggör också studiet av komplexa interaktioner mellan relevanta celltyper under sjukdomstillstånd. 29
Sammanfattningsvis, den orgel-on-chip-enhet som beskrivs i denna publikation kan fabriceras använder vanlig laboratorieutrustning och visas att ge direkta TEER mätningar med fyra integrerade elektroder som inte hindrar okulärbesiktning av cellen studerade skikt. Tillämpligheten av denna enhet i fältet organ-på-chips demonstrerades genom att härma BBB i detta chip och övervaka TEER under perioden kultur. En mängd andra (barriär) organ kan vara härmade av inklusive andra relevanta celltyper i detta chip. Dessutom kan metoden för mätning TEER lätt tillämpas i andra två fack-baserade orgel-on-chip-enheter att anlända vid reproducerbar och meningsfull TEER-värden som kan jämföras mellan enheter och system.
The authors have nothing to disclose.
Vi erkänner tacksamt Johan Bomer för tillverkning av mögel och Mathijs Bronkhorst för givande diskussioner och hjälp med datarepresentation.
Denna forskning har finansierats av: SRO biomedicinsk Microdevices av L.I. Segerink, MIRA Institutet för medicinsk teknik och tekniska medicin, universitetet i Twente; SRO organ-på-Chips A.D. van der Meer, MIRA-Institutet för medicinsk teknik och tekniska medicin, universitetet i Twente; och VESCEL, ERC Advanced Grant A. van den Berg (grant nr 669768).
Materials | |||
Polydimethylsiloxane (PDMS) base agent and curing agent: Sylgard 184 Silicone elastomer kit | Dow Corning | 1673921 | |
Scotch Magic tape | 3M | ||
Biopsy punch, 1.0 mm diameter | Integra Miltex | 33-31AA-P/25 | |
Polycarbonate membrane, 0.4 µm pore size | Corning | 3401 | Cut from Transwell culture inserts |
Toluene | Sigma-Aldrich | 244511 | |
Platinum wire, 200 µm diameter | Alfa Aesar | 10287 | |
UV-curable adhesive: Norland Optical Adhesive 81 | Norland Products | NOA 81 | |
Epoxy adhesive: Loctite M-31 CL Hysol | Henkel | 30673 | |
hCMEC/D3 cells | Human cerebral microvascular endothelial cell line, kindly provided by Dr. P.-O. Couraud, INSERM, Paris, France | ||
Phosphate buffered saline (PBS) | Sigma | P4417 | |
Human plasma fibronectin, 20 µg/ml | Gibco | 33016015 | |
Endothelial growth medium-2 (EGM-2) | Lonza | CC-3162 | Endothelial basal medium-2 (EBM-2) supplemented with EGM-2 SingleQuots |
Trypsin-EDTA, 0.05% | Gibco | 15400-054 | |
Fetal bovine serum (FBS) | Gibco | 26140-079 | |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Equipment | |||
Oven | Binder | 9010-0190 | |
Spin coater: Spin 150 | Polos | SPIN150-NPP | |
UV light source, 365 nm for 5 s at 350 mW/cm2 | Manufactured in-house | ||
Centrifuge: Allegra X-12R Centrifuge | Beckman Coulter | ||
Incubator | Binder | CB E2 150 | |
Boxense | LocSense | Lock-in amplifier with probe cable circuit, specialized for on-chip TEER measurements |