ゼブラフィッシュ幼虫の改良実験操作のための長期のライブ イメージング デバイス
Summary
本稿では、zWEDGI を説明します (ゼブラフィッシュ成長とイメージングのためのわなに掛ける事のデバイスと傷害)、オリエント、ゼブラフィッシュ幼虫を抑制するように設計の区画化装置であります。デザインは、離断尾と創傷治癒と再生の高解像度蛍光顕微鏡画像の長期的なコレクションを許可します。
Abstract
ゼブラフィッシュの幼虫は、発生生物学と創傷治癒過程の両方の重要なモデル生物です。さらに、ゼブラフィッシュの幼虫は細胞の分解能で時間と空間の動的な生命現象のライブ高解像度顕微鏡イメージングの貴重なシステムです。しかし、幼虫の発育と組織再生、ライブ イメージングの agarose のカプセル化の伝統的な方法が低下します。したがって、本稿では、zWEDGI を説明します (ゼブラフィッシュ成長とイメージングのためのわなに掛ける事のデバイスと傷害) を設計・製作を確保しながら高分解能顕微鏡の幼虫を方向づけるための機能的区画化装置としてデバイスとその後の気ままな尾開発と再成長内尾鰭断裂。このデバイスは、負傷と生存率を維持しながら長期的なイメージングできます。ZWEDGI 型は、3 D プリントは、そのジオメトリのカスタマイズ性は多様なゼブラフィッシュ イメージング アプリケーションを簡単に変更、です。さらに、zWEDGI は、負傷や試薬の応用実験中に幼虫へのアクセスなど、数多くの利点は並列合理化されたイメージングのための複数の幼虫の方向とデバイスの再利用性を提供しています。
Introduction
ゼブラフィッシュ仔動脈分布の再生能力ように理想的なモデル有機体傷害応答として、癒しと再生1,2,3、4を調べること。アクセス トランスジェニックゼブラフィッシュ ラインおよびゼブラフィッシュの解剖学的なさらなる透明性の配列には、傷応答イベントとして長期的な再生プロセス4の研究生体内でそのユーティリティを強化します。したがって高画質タイムラプス蛍光顕微鏡を使用してこれらの生物学的過程の研究は、生存率を維持しながら高い安定性とゼブラフィッシュ幼虫の最小限の動きは、ライブ イメージング ゼブラフィッシュ デバイスを要求します。それはキー デバイスにより、ヒーリングしながら効果的な負傷のため、再生発生装置によって影響を受けないです。
Agarose のライブ イメージング中に幼虫を埋め込みの標準的なライブ画像安定化方法の成長を制限する傷の再生5と幼虫が 4 の後心臓ストレスと組織壊死の徴候を示し始めるので、死亡率を高める可能性があります。時間4。したがって、関心領域から agarose の除去は正常な開発を許可する必要があります、再生6、agarose として潜在的な損傷に幼虫を公開を切り取る。さらに、技術を埋め込みアガロースとユーザーを方向づけなければならない短い時間で幼虫 agarose5,6,7を固化する前に。急速に幼虫を操作するだけでなくユーザーのスキルが必要です、それはまた幼虫への損傷のリスクします。シリコン真空使用グリース、塩ビ配管その他イメージング室を作成する畝寒天井戸3または divets8など、これらの欠点を回避するためにライブ イメージングのための幼虫を安定させるための方法が記載されているが材料6と回転チューブ9、これらのメソッドの多くの集中的な厄介な多くの場合非再利用可能、労働環境操作を許可しない (薬物治療、負傷など。) 魚がマウントされた後。
したがって、zWEDGI デバイス (図 1) は、寒天試料の操作中ゼブラフィッシュ幼虫の長期のライブ イメージングを使用する実装の欠点のいくつかを克服するために設計されました。ZWEDGI は、荷重、拘束、負傷、2 〜 4 日後受精ゼブラフィッシュ幼虫のイメージングの 3 セミオープン区分室を許可する (図 1 a) で構成されます。デバイスはポリジメチルシロキサン (PDMS) からを作製し、60 mm ガラス下部イメージング皿のカバー スリップの上に配置されます。モジュラー デザインと標準的な製造技術の使用変更に対応しやすく、プロシージャの特に実験プロシージャの様々 な zWEDGI デザインただしここで示した設計は創傷治癒研究、意図されていたこと実験操作と長期的なイメージングの最小限の拘束が必要です。
Protocol
Representative Results
Discussion
ZWEDGI デバイスの目的は、安定化と高分解能対物レンズの小さな作業距離内にある魚の定位によるイメージング 3 D タイムラプスをキャプチャすることです。これらの仕様を満たしながらそれはまた、以上改善ライブ イメージングのための伝統的な寒天製剤です。正しく行われていない場合によって、欠陥のあるデバイスを zWEDGI の作製 (下記参照) の 3 つの重要な手順があります。
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The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
著者は、プライマリ プロジェクトの光の計算の計測研究所の Morgridge 研究所から資金調達を認めたいと思います。我々 はまた、NIH # R01GM102924 から資金を認める (AH と近鉄)。KH、JMS、RS、AH、KWE 構想し、研究に設計されています。KH と JMS DL、KP、RS からのサポートとすべての実験を実行します。KH、JS、RS、AH、KWE は原稿の執筆に貢献。
Materials
| Fabricate molds | |||
| Solidworks Professional Accedemic Research 3D modeling software | Dassault Systemes | SPX0117-01 | Fisher Unitech |
| Viper Si2 SLA 3D printer | 3D Systems Inc. | 23200-902 | 3D Systems Inc. |
| Accura 60 photopolymer resin | 3D Systems Inc. | 24075-902 | 3D Systems Inc. |
| denatured alcohol | Sunnyside | 5613735 | Menards |
| UV post cure apparatus | 3D Systems Inc. | 23363-101-00 | 3D Systems Inc. |
| TouchNTuff nitrile gloves | Ansell | 92-600 | McMaster Carr |
| 220B, 400B, 600 grit T414 blue-bak sandpaper | Norton | 66261139359, 54, 52 | MSC |
| borosilicate glass disc, 2" diameter | McMaster-Carr | MIL-G-47033 | McMaster-Carr |
| ultrasonicator cleaner | Branson | 1510R-MTH | |
| isopropyl rubbing alcohol 70% | Hydrox | 54845T43 | McMaster-Carr |
| 10oz clear plastic cup | WNA Masterpiece | 557405 | Amazon |
| 6"craft stick | Perfect Stix | Craft WTD-500 | Amazon |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Fabricate zWEDGI PDMS device | |||
| Sylgard 184 silicon elastomeric kit | Dow-Corning | 4019862 | Ellworth Adhesives |
| 10mL syringe | Becton Dickinson | 305219 | Vitality Medical Inc |
| desiccator | Bel-Art Scienceware | F42027-0000 | Amazon |
| 4 in ratcheting bar clamp | Pittsburgh | 68974 | Harbor Freight |
| lab oven | Quincy Lab Inc. | 20GC | Global Industrial |
| tweezer set | Aven | 549825 | McMaster-Carr |
| compressed air filtered nozzle | Innotech | TA-N2-2000FT | Cleanroom Supply |
| vacuum bench vise | Wilton Tool Group | 63500 | MSC Industrial |
| 55mm glass bottom dish; 30mm micro-well #1.5 cover glass | Cellvis | D60-30-1.5-N | Cellvis |
| plasma cleaner | Harrick Plasma | PDC-001 | Harrick Plasma |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Loading Larvae | |||
| Pipetteman, P200 | Gilson | F123601 | |
| 100% ethanol (diluted to 70% with water prior to use) | Pharmco-aaper | 111000200 | |
| Transfer pipette | Fisherbrand | 13-711-5A | Fisher Scientific |
| powdered skim milk | 2902887 | MP Biomedicals | |
| double distilled water | |||
| N-phenylthiorurea | Sigma-Aldrich | P7629 | Sigma-Aldrich |
| tricaine (ethyl 3-aminobenzoate) | C-FINQ-UE | Western Chemical | |
| low melting point agarose | Sigma-Aldrich | A0701 | Sigma-Aldrich |
| heat block (dry bath incubator) | Fisher Scientific | 11-718-2 | Fisher Scientific |
| E3 buffer | |||
| large orifice pipette tip, 200 uL | Fisherbrand | 02-707-134 | Fisher Scientific |
| General purpose pipette tip, 200 uL | Fisherbrand | 21-197-8E | Fisher Scientific |
| #15 scalpel blade | Feather | 2976 | Amazon |
| 25G syringe needle | BD | BD305122 | Fisher Scientific |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Imaging | |||
| inverted microscope | |||
| Imaris imaging software | Bitplane |
Referências
- Yoo, S. K., Freisinger, C. M., LeBert, D. C., Huttenlocher, A. Early redox, Src family kinase, and calcium signaling integrate wound responses and tissue regeneration in zebrafish. J. Cell Biology. 199 (2), 225-234 (2012).
- Kawakami, A., Fukazawa, T., Takeda, H. Early fin primordia of zebrafish larvae regenerate by a similar growth control mechanism with adult regeneration. Dev. Dynam. 231 (4), 693-699 (2004).
- Konantz, J., Antos, C. L. Reverse genetic morpholino approach using cardiac ventricular injection to transfect multiple difficult-to-target tissues in the zebrafish larva. JoVE. (88), (2014).
- Hall, C., Flores, M. F., Kamei, M., Crosier, K., Crosier, P., Sampath, K., Roy, S. Live Imaging Innate Immune Cell Behavior During Normal Development, Wound Healing and Infection. Live Imaging in Zebrafish: Insights into Development and Disease. , (2010).
- Huemer, K., Squirrell, J. M., Swader, R., LeBert, D. C., Huttenlocher, A., Eliceiri, K. W. zWEDGI: Wounding and Entrapment Device for Imaging Live Zebrafish Larvae. Zebrafish. , (2016).
- Lisse, T. S., Brochu, E. A., Rieger, S. Capturing tissue repair in zebrafish larvae with time-lapse brightfield stereomicroscopy. JoVE. (95), (2015).
- Kamei, M., Isogai, S., Pan, W., Weinstein, B. M. Imaging blood vessels in the zebrafish. Methods Cell Biol. 100, 27-54 (2010).
- Graeden, E., Sive, H. Live imaging of the zebrafish embryonic brain by confocal microscopy. JoVE. (26), (2009).
- Petzold, A. M., Bedell, V. M., et al. SCORE imaging: specimen in a corrected optical rotational enclosure. Zebrafish. 7 (2), 149-154 (2010).
- Macdonald, N. P., Zhu, F., et al. Assessment of biocompatibility of 3D printed photopolymers using zebrafish embryo toxicity assays. Lab Chip. 16 (2), 291-297 (2016).
- LeBert, D. C., Squirrell, J. M., Huttenlocher, A., Eliceiri, K. W. Second harmonic generation microscopy in zebrafish. Methods Cell Biol. 133, 55-68 (2016).
- White, R. M., Sessa, A., et al. Transparent Adult Zebrafish as a Tool for In Vivo Transplantation Analysis. Cell Stem Cell. 2 (2), 183-189 (2008).
- LeBert, D. C., Squirrell, J. M., et al. Matrix metalloproteinase 9 modulates collagen matrices and wound repair. Development. 142 (12), 2136-2146 (2015).
- Campagnola, P. J., Millard, A. C., Terasaki, M., Hoppe, P. E., Malone, C. J., Mohler, W. A. Three-dimensional high-resolution second-harmonic generation imaging of endogenous structural proteins in biological tissues. Biophys. J. 82 (1 Pt 1), 493-508 (2002).
- Schindelin, J., Arganda-Carreras, I., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nat. Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
