Quantificação de microrganismos em baixas concentrações, utilizando microscopia holográfica Digital (DHM)
Summary
Microscopia holográfica digital (DHM) é uma técnica volumétrica que permite amostras de imagens realizadas 50-100x mais espesso que brightfield microscopia em resolução comparável, com o foco de pós-processamento. Aqui DHM é usado para identificar, contando e acompanhamento de microorganismos em muito baixas densidades e em comparação com medições de densidade óptica, contagem de placa e contagem direta.
Abstract
Com a detecção e contagem de amostras bacterianas esparsas tem muitas aplicações na comida, bebidas e indústrias de processamento farmacêutico, em diagnósticos médicos e para a detecção de vida por missões robóticas para outros planetas e luas do sistema solar. Atualmente, esparsas amostras bacterianas são contadas por microscopia de chapeamento ou epifluorescência de cultura. Placas de cultura exigem longo tempo de incubação (dias ou semanas) e microscopia de epifluorescência requer mancha extensa e concentração da amostra. Aqui, demonstramos como usar fora do eixo microscopia holográfica digital (DHM) para enumerar as bactérias em culturas muito diluídas (100-104 células/mL). Em primeiro lugar, a construção da DHM personalizado é discutida, juntamente com instruções detalhadas sobre a criação de um instrumento de baixo custo. São discutidos os princípios da holografia, e um modelo estatístico é usado para estimar quanto tempo vídeos devem ser para detectar células, com base nas características desempenho óptico do instrumento e a concentração da solução bacteriana (tabela 2) . A detecção de células em 105, 104, 103e 100 células/mL é demonstrada em tempo real usando hologramas un-reconstruídos. Reconstrução de imagens de amplitude e fase é demonstrada usando um pacote de software open-source.
Introduction
Determinação da precisa contagens bacterianas em amostras muito diluídas é crucial em muitas aplicações: alguns exemplos são a água e a comida qualidade análise1,2,3; deteção de patógenos no sangue, líquido cefalorraquidiano ou escarro4,5; produção de produtos farmacêuticos, incluindo água estéril6; e análise ambiental da Comunidade em ambientes oligotróficos como o aberto oceano e sedimentos7,8,9. Existe também uma crescente interesse para detecção de possível vida microbiana existente nas luas geladas de Júpiter e Saturno, particularmente Europa10,11 e Enceladus12,13, 14, que são conhecidos por terem subsuperficiais oceanos líquidos. Porque nenhuma missão desde Viking em 1978 tem tentado encontrar existe vida em outro planeta, tem havido desenvolvimento limitado de tecnologias e instrumentos de identificação bacteriana e contando durante espaço missões15.
Os métodos tradicionais de contagem de placa encontrar apenas células viáveis, que podem representar uma minoria das espécies em cepas ambientais, às vezes < 1%16. Placas requerem dias ou semanas de incubação para o máximo de sucesso, dependendo da estirpe. Microscopia de epifluorescência substituiu, em larga medida, contagens das placas como o padrão ouro para enumeração microbiana rápida e exata. Corantes de fluorescentes nucleic-ácido-rotulagem como laranja de acridina, dicloridrato 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI), SYBR Green ou 4 ‘ que se ligam aos ácidos nucleicos são os corantes típicos usados17,18,19 , apesar de muitos estudos utilizam indicadores fluorescentes de grama assinar20,21,22,23,24. Usando esses métodos sem etapas de pré-concentração leva à limites de detecção (LoDs) de ~ 105 células por mL. Melhorias no LoD são possíveis usando filtragem. Uma amostra de líquido é filtrada vácuo em uma membrana, geralmente em policarbonato e idealmente preto para reduzir a fundo. Baixo-fundo corantes tais como as manchas de DNA mencionadas acima podem ser aplicadas directamente para o filtro de25. Para contagem exata pelo olho, as células de5 ~ 10 são necessárias por filtro, o que significa que, para amostras mais diluídas do que 10 ~5 células por mL, volumes significativos de amostra devem ser recolhidas e filtradas. Dispositivos de varredura a laser foram desenvolvidos a fim de explorar sistematicamente todas as regiões do filtro e, assim, reduzir o número de células necessárias para a contagem, empurrando os limites de detecção até ~ 102 células por mL26. No entanto, estes não estão disponíveis na maioria dos laboratórios e exigem hardware sofisticado, assim como software que permitem a confirmação de perita que observou partículas é as bactérias e não os restos.
Para referência, adultos com sepse geralmente começam a mostrar sintomas de < 100 células/mL de sangue e bebês em < 10 células/mL. Uma recolha de sangue de um adulto leva 10 mL e de uma criança, 1ml. Métodos baseados em PCR são inibidos pela presença de humano e não-patogênicas flora DNA e pelos componentes do PCR-inibindo o sangue27,28. Apesar de uma variedade de técnicas emergentes, culturas permanecem o padrão ouro para o diagnóstico de infecções da corrente sanguínea, especialmente em zonas mais rurais ou nações em desenvolvimento. Detecção de vida em outros planetas, cálculos termodinâmicos podem estimar o orçamento de energia para a vida e, portanto, a biomassa possível esperada. 1 – 100 células/mL são esperados ser termodinamicamente razoável na Europa29. Pode ser facilmente visto destes números que a detecção de um pequeno número de células em grandes quantidades de solução aquosa é um importante problema sem solução.
Neste artigo, demonstramos a detecção de Serratia marcescens e Shewanella oneidensis (tipo selvagem e non-motile mutante) em concentrações de 105, 104, 10 e 100 células/mL usando um fora do eixo3 microscópio digital holográfico (DHM). A principal vantagem da DHM por microscopia de luz tradicional é a imagem simultânea de um volume de amostra espesso em alta resolução — nessa implementação, a câmara de amostra foi de 0,8 mm de espessura. Estas câmaras de amostra foram construídas pelo macio-litografia de polidimetilsiloxano (PDMS) de um molde de alumínio de precisão usinadas com uma tolerância de ± 50 µm. Isto representa uma melhoria de aproximadamente 100 vezes em profundidade de campo através de microscopia de luz de alta potência. DHM também fornece informações de fase quantitativa, permitindo a medição do comprimento do percurso óptico (produto do índice de refração e espessura). DHM e técnicas semelhantes têm sido utilizadas para monitoramento de bacteriano e ciclo celular de levedura e cálculo de massa seca bacteriana30,31,32; diferenças de dispersão mesmo podem ser usadas para diferenciar estirpes bacterianas33.
O instrumento que usamos é costume-construído especificamente para uso com microorganismos, como publicado anteriormente34,,35, e seu design e construção são demonstrados e discutidos. Soluções aquosas são continuamente fornecidas a uma câmara de amostra de volume µ l 0,25 através de bomba de seringa; a taxa de fluxo é determinada pela taxa de quadros da câmera para assegurar imagens volume da amostra inteira. Um cálculo estatístico prevê que o número de volumes de amostra que deve ser fotografada a fim de detectar um número significativo de células em uma dada concentração.
Para aplicações de célula-deteção, reconstrução de hologramas em amplitude e fase de imagens não era exigida; análise foi realizada no holograma cru. Isso economiza espaço em disco e recursos computacionais significativos: um holograma de 500 Mb vídeo será 1 a 2 Tb quando reconstruído. No entanto, podemos discutir reconstrução através da profundidade da amostra para confirmar que os hologramas representam a espécie desejada. Uma característica importante da DHM é sua capacidade de monitorar tanto a intensidade e a fase das imagens. Organismos que são quase transparentes em intensidade (como a maioria das células biológicas) aparecem claramente em fase. Como é uma técnica livre de rótulo, não são utilizados corantes. Este é um umdvantage para aplicações de voo de espaço possível, desde que corantes podem não sobreviver as condições de uma missão e — mais importante — não pode ser presumida a trabalhar com organismos extraterrestres, que não podem usar o DNA ou RNA para codificação. Também é uma vantagem para o trabalho em ambientes extremos, tais como o Ártico e Antártico, onde corantes podem ser difíceis de trazer para o local remoto e podem degradar após armazenamento. Reconstrução de imagens em fase e amplitude é executada usando um pacote de software open-source que disponibilizamos no GitHub (SHAMPOO) ou usando o ImageJ.
Protocol
Representative Results
Discussion
Reconstrução numérica de hologramas: para a reconstrução numérica de hologramas, é usado o método do espectro angular (ASM). Isso envolve a convolução do holograma com a função Green para a DHM. O wavefront complexo da imagem em um determinado plano focal pode ser calculada utilizando o teorema da convolução Fourier como segue:
(1)
Onde <img alt="Equation 3" src="/files/f…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Os autores reconhecem o Gordon e Betty Moore Foundation Grants 4037 e 4038 ao Instituto de tecnologia da Califórnia, para o financiamento deste trabalho.
Materials
| Bacto Yeast | BD Biosciences | 212750 | |
| Bacto Tryptone | BD Biosciences | 211705 | |
| Sodium chloride | Sigma-Aldrich | 7710 | Many options for purchase |
| Bacto Agar | BD Biosciences | 214010 | |
| 10 cm Petri dishes | VWR | 10053-704 | |
| 15 mL culture tubes | Falcon (Corning Life Sciences) | 352002 | Loose-capped |
| Petroff-Hauser chamber | Electron Microscopy Sciences | 3920 | |
| 10 mL syringes | BD Biosciences | 309604 | Luer-Lok tip not necessary |
| Male Luer to 1/16” barbed fitting | McMaster-Carr | 51525K291 | |
| Autoclavable 1/16” ID PVC tubing for flow | Nalgene | 8000-0004 | Sold by length, purchase accordingly |
| Syringe pump | Harvard Apparatus | PHD 2000 | |
| Sample Chamber | Custom | n/a | See Materials Section |
| Holographic Microscope | Custom | n/a | See Wallace et al. |
| Open-source software | Custom | https://github.com/bmorris3/shampoo |
Referências
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