Vi præsenterer en protokol til at dissekere hypofyse og forberede hypofyse koronale sektioner fra udvikle mus.
Hypofysen eller hypofysen er en vigtig endokrine organ udskiller hormoner afgørende for homeostase. Det består af to kirtler med separat embryonale oprindelse og funktioner — neurohypophysis og adenohypophysis. Udvikle mus hypofyse kirtel er lille og delikat med en aflang oval form. En koronale del er foretrukket at vise både adenohypophysis og neurohypophysis i en enkelt skive af musen hypofysen.
Målet med denne protokol er at opnå ordentlig hypofyse koronale sektioner med velbevarede væv arkitekturer fra udvikle mus. I denne protokol beskriver vi i detaljer hvordan man kan dissekere og behandle hypofyse korrekt fra udvikle mus. Først, mus er fastsat af transcardial perfusion af formaldehyd før dissektion. Derefter anvendes tre forskellige dissekere teknikker for at opnå intakt hypofyse afhængigt af alder af mus. For føtal mus alderen embryonale dage (E) 17,5-18,5 og nyfødte op til 4 dage, er hele sella regioner herunder kilebenet, kirtel og trigeminus nerver dissekeret. For hvalpe er alderen postnatal dage (P) 5-14, hypofyse forbundet med trigeminus nerver dissekeret som helhed. For mus over 3 uger gamle, er hypofyse omhyggeligt dissekeret gratis fra det omgivende væv. Vi viser også hvordan man kan integrere hypofyse i en ordentlig orientering ved hjælp af det omgivende væv som vartegn for at opnå tilfredsstillende koronale sektioner. Disse metoder er nyttige i at analysere histologiske og udviklingsmæssige funktioner af hypofyse udvikle mus.
Hypofysen eller hypofysen er en vigtig endokrine organ udskiller hormoner afgørende for homeostase1,2. Anatomisk, er hypofysen en ” to-i-én ” struktur bestående af neurohypophysis og adenohypophysis. Disse dele har forskellig embryonale oprindelse og funktion meget forskelligt. Neurohypophysis er afledt af neurale ectoderm og udskiller oxytocin og antidiuretisk hormon. Adenohypophysis stammer fra Rathkes pose og er ansvarlig for frigivelse af hormoner, herunder væksthormon, prolaktin, thyreoidea – stimulerende hormon, follikel – stimulerende hormon, luteiniserende hormon, adrenokortikotropt hormon, og melanocyte – stimulerende hormon3,4,5.
Hypofysen hviler på den dorsale overflade af sphenoid knoglen (sella turcica) mus kraniet og er fastgjort til gulvet i hjernen ved en skrøbelig stilk. Det er omgivet sideværts af trigeminus nerver og anteriorly af optiske chiasm6,7. Kirtlen har en aflang oval form med sin lange akse vinkelret hovedet. På sin dorsale overflade, kan neurohypophysis og adenohypophysis nemt afgrænses, med den tidligere besat den dorsale mediale region og den sidstnævnte strækker sig lateralt og ventrally. Under postnatal udvikling, størrelsen af hypofyse stiger hurtigt i den første måned efter fødslen8,9. Ikke desto mindre er mus hypofysen stadig meget lille i størrelse med en gennemsnitlig vægt på 1,9 mg og en lang-akse diameter på ~ 3 mm i voksen10, en lang-akse diameter på 2-2,5 mm på postnatal dag 21 (P21), og kun 1-1,5 mm på P0.
En koronale del er foretrukket at vise både adenohypophysis og neurohypophysis i en enkelt skive af musen hypofysen. Dog er nogle tekniske færdigheder kræves for at opnå tilfredsstillende koronale sektioner af hypofyse fra udvikle mus på grund af sin usædvanligt lille størrelse og forskellige anatomi. I denne video artikel viser vi, hvordan dissekere mus hypofyse og forberede hypofyse koronale sektioner på forskellige udviklingsfaser.
For at udvikle murine pituitaries, har det været teknisk vanskeligt at opnå ordentlig koronale sektioner på grund af deres lille og skrøbelig funktioner og unikke anatomiske karakteristika6,8. Nogle forskningsgrupper således valgte midten af sagittal sektioner til at analysere morfologi af embryonale og neonatal hypofyse11,12. Midten af sagittal sektion af hypofysen er også i stand til at vise anter…
The authors have nothing to disclose.
Dette arbejde blev støttet af tilskud fra National Natural Science Foundation of China (31201086, 31470759 og 31671219) og Shanghai Natural Science Foundation (12ZR1436900).
Tools/Equipment | |||
Surgical scissors-straight | JinZhong | J21010 | can be purchased from other vendors |
Fine scissors-strainght | JinZhong | WA1010 | can be purchased from other vendors |
Blunt forceps | JinZhong | JD1020 | can be purchased from other vendors |
Fine forceps | Dumont | RS-5015 | for isolation of the pituitary |
26G (0.45mm) needle | HongDa | for transcardial perfusion | |
Syringe (1 mL) | BD | 300841 | can be purchased from other vendors |
Syringe (10 mL) | BD | can be purchased from other vendors | |
35mm dish | Corning | 430165 | can be purchased from other vendors |
Lens cleaning paper | ShuangQuan | can be purchased from other vendors | |
Anatomical microscope | OLYMPUS | SZX-ILLB2-200 | can be purchased from other vendors |
Embedding cassette | Thermo Fisher | 22-272423 | can be purchased from other vendors |
Tissue embedding console system | KEDEE | KD-BM11 | can be purchased from other vendors |
Microtome | Thermo Fisher | HM315R | can be purchased from other vendors |
Superfrost-Plus slides | Thermo Fisher | 22-037-246 | can be purchased from other vendors |
Cover glass | Thermo Fisher | 12-543 | can be purchased from other vendors |
Fluorescence microscope | OLYMPUS | BH2-RFCA | can be purchased from other vendors |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Reagents | |||
Urethane | BBI | EB0448 | |
NaCl | Sigma | S9625 | for PBS |
KCl | Sigma | P9541 | for PBS |
Na2HPO4.12H2O | Sigma | 71650 | for PBS |
K2HPO4 | Sigma | P2222 | for PBS |
NaNO2 | Sigma | 237213 | |
Heparin Sodium Injection | SPH | H31022051 | for perfusion saline |
Paraformaldehyde (PFA) | Sigma | P6148 | |
Ethanol | SCR | 10009218 | |
Xylene | SCR | 10023418 | |
Paraffin | Thermo Fisher | 8330 | |
Hematoxylin | Sigma | H9627 | for H&E staining |
Eosin Y | Sigma | E4009 | for H&E staining |
rabbit anti growth hormone (GH) | National Hormone | for immunostaining | |
antibody | Pituitary Program | ||
Rabbit anti-mouse GFAP antibody | Sigma | G9269 | for immunostaining |
Goat anti-rabbit IgG, HRP | Jackson | 111-035-003 | for immunostaining |
TSA system | NEN Life Science Products | NEL700 | for immunostaining |
Streptavidin, Alexa Fluor 594 | Thermo Fisher | S32356 | for immunostaining |
Anti-FITC Alexa Fluor 488 | Thermo Fisher | A11090 | for immunostaining |