Dissecação e preparação Coronal fatia de desenvolver Mouse hipófise
Summary
Apresentamos um protocolo para dissecar as glândulas pituitárias e preparar na hipófise coronais seções de desenvolvimento de ratos.
Abstract
A glândula pituitária ou hipófise é um importante órgão endócrino secreção de hormônios essenciais para a homeostase. É constituída por duas glândulas com funções e origens embrionárias distintas — a neuro-hipófise e a adenohipófise. A desenvolvimento do mouse hipófise é minúsculo e delicado com uma forma oval alongada. Uma secção coronal é preferida para exibir tanto a adenohipófise e neuro-hipófise em uma única fatia da hipófise do mouse.
O objetivo do presente protocolo é conseguir a adequada da hipófise secções coronais com arquiteturas de tecido bem preservado de desenvolver ratos. Neste protocolo, descrevemos em detalhe como dissecar e processo hipófises corretamente de desenvolvimento de ratos. Primeiro, os ratos são fixos por perfusão transcardial de formaldeído antes da dissecação. Em seguida, três diferentes técnicas de dissecação são aplicadas para obter intactas as glândulas pituitárias, dependendo da idade dos ratos. Para ratos fetais entre embrionários dias (E) 17,5-18.5 e neonatos acima de 4 dias, as regiões de sella inteira, incluindo o osso esfenoide, glândulas e nervos trigêmeo são dissecadas. Para filhotes idade pós-natal dias (P) 5-14, as glândulas pituitária conectados com os nervos trigêmeo são dissecados como um todo. Para ratos mais de 3 semanas de idade, as glândulas pituitária são cuidadosamente dissecadas de graça os tecidos circundantes. Também exibimos como incorporar as glândulas pituitária em uma orientação correta usando os tecidos circunvizinhos como Marcos para obter satisfação secções coronais. Esses métodos são úteis na análise de características histológicas e do desenvolvimento das glândulas pituitária no desenvolvimento de ratos.
Introduction
A glândula pituitária ou hipófise é um importante órgão endócrino secreção de hormônios essenciais para a homeostase1,2. Anatomicamente, a glândula pituitária é uma estrutura ‘ dois-em-um ‘ da neuro-hipófise e a adenohipófise. Estas peças têm a função e diferentes origens embrionárias muito diferentemente. A neuro-hipófise é derivada do ectoderma neural e segrega ocitocina e hormônio antidiurético. A adenohipófise origina-se de bolsa de Rathke e é responsável para a liberação de hormônios, incluindo o hormônio do crescimento, prolactina, hormônio estimulante da tireoide, hormônio folículo estimulante, hormônio luteinizante, hormônio adrenocorticotrófico, e melanócito – estimulante hormônio3,4,5.
A glândula pituitária baseia-se na superfície dorsal do osso esfenoide (sella turcica) do crânio do mouse e é ligada ao pavimento do cérebro por um frágil caule. Está rodeada lateralmente pelos nervos trigêmeo e anteriormente pelo quiasma óptico6,7. A glândula tem uma forma oval alongada com seu longo eixo perpendicular a isso da cabeça. Em sua superfície dorsal, a neuro-hipófise e a adenohipófise podem facilmente ser demarcadas, com a primeira ocupando a região dorsal medial e o último estendendo lateralmente e ventralmente. Durante o desenvolvimento pós-natal, o tamanho da hipófise aumenta rapidamente no primeiro mês após o nascimento de8,9. Não obstante, a hipófise de rato ainda é muito pequena em tamanho, com um peso médio de 1,9 mg e long-eixo de ~ 3 mm de diâmetro em adulto10, um diâmetro de eixo longo de 2-2,5 mm no pós-Natal dia 21 (P21) e apenas de 1-1,5 mm em P0.
Uma secção coronal é preferida para exibir ambos adenohipófise e neuro-hipófise em uma única fatia da hipófise do mouse. No entanto, algumas habilidades técnicas são necessárias para obter a satisfação secções coronais de glândulas pituitárias de desenvolver ratos devido ao seu tamanho extremamente pequeno e anatomia distinta. Neste artigo de vídeo, demonstramos como dissecar as glândulas pituitárias de rato e preparar secções coronais da hipófise em diferentes estágios de desenvolvimento.
Protocol
Representative Results
Discussion
Para o desenvolvimento de murino pituitaries, tem sido difícil tecnicamente obter as seções coronais adequadas, devido a suas características de pequenas e frágil e características anatômicas únicas6,8. Alguns grupos de pesquisa assim escolhi meados-sagital seções para analisar a morfologia do embrionário e neonatal na hipófise11,12. Embora a meados-sagital da hipófise também é capaz de mos…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabalho foi apoiado pelas concessões do Nacional Natural Science Foundation da China (31201086, 31470759 e 31671219) e a Fundação de ciência Natural de Shanghai (12ZR1436900).
Materials
| Tools/Equipment | |||
| Surgical scissors-straight | JinZhong | J21010 | can be purchased from other vendors |
| Fine scissors-strainght | JinZhong | WA1010 | can be purchased from other vendors |
| Blunt forceps | JinZhong | JD1020 | can be purchased from other vendors |
| Fine forceps | Dumont | RS-5015 | for isolation of the pituitary |
| 26G (0.45mm) needle | HongDa | for transcardial perfusion | |
| Syringe (1 mL) | BD | 300841 | can be purchased from other vendors |
| Syringe (10 mL) | BD | can be purchased from other vendors | |
| 35mm dish | Corning | 430165 | can be purchased from other vendors |
| Lens cleaning paper | ShuangQuan | can be purchased from other vendors | |
| Anatomical microscope | OLYMPUS | SZX-ILLB2-200 | can be purchased from other vendors |
| Embedding cassette | Thermo Fisher | 22-272423 | can be purchased from other vendors |
| Tissue embedding console system | KEDEE | KD-BM11 | can be purchased from other vendors |
| Microtome | Thermo Fisher | HM315R | can be purchased from other vendors |
| Superfrost-Plus slides | Thermo Fisher | 22-037-246 | can be purchased from other vendors |
| Cover glass | Thermo Fisher | 12-543 | can be purchased from other vendors |
| Fluorescence microscope | OLYMPUS | BH2-RFCA | can be purchased from other vendors |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagents | |||
| Urethane | BBI | EB0448 | |
| NaCl | Sigma | S9625 | for PBS |
| KCl | Sigma | P9541 | for PBS |
| Na2HPO4.12H2O | Sigma | 71650 | for PBS |
| K2HPO4 | Sigma | P2222 | for PBS |
| NaNO2 | Sigma | 237213 | |
| Heparin Sodium Injection | SPH | H31022051 | for perfusion saline |
| Paraformaldehyde (PFA) | Sigma | P6148 | |
| Ethanol | SCR | 10009218 | |
| Xylene | SCR | 10023418 | |
| Paraffin | Thermo Fisher | 8330 | |
| Hematoxylin | Sigma | H9627 | for H&E staining |
| Eosin Y | Sigma | E4009 | for H&E staining |
| rabbit anti growth hormone (GH) | National Hormone | for immunostaining | |
| antibody | Pituitary Program | ||
| Rabbit anti-mouse GFAP antibody | Sigma | G9269 | for immunostaining |
| Goat anti-rabbit IgG, HRP | Jackson | 111-035-003 | for immunostaining |
| TSA system | NEN Life Science Products | NEL700 | for immunostaining |
| Streptavidin, Alexa Fluor 594 | Thermo Fisher | S32356 | for immunostaining |
| Anti-FITC Alexa Fluor 488 | Thermo Fisher | A11090 | for immunostaining |
Referências
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