Dissektion och koronalt Slice förberedelse att utveckla mus hypofysen
Summary
Vi presenterar ett protokoll för att dissekera hypofys och förbereda hypofysen koronalt avsnitt från att utveckla möss.
Abstract
Den hypofysen eller hypofysen är ett viktigt endokrina organ som utsöndrar hormoner som är väsentliga för homeostas. Den består av två körtlar med separat embryonala ursprung och funktioner — neurohypophysis och i adenohypofysen. Utveckla mus hypofysen är mycket liten och delikat med en långsträckt oval form. En koronalt avsnitt föredras att visa både adenohypofysen och neurohypophysis i en enda bit av mus hypofysen.
Målet med detta protokoll är att uppnå korrekt hypofysen koronalt avsnitt med välbevarad vävnad arkitekturer från att utveckla möss. I detta protokoll beskriver vi i detalj hur du dissekera och bearbetar hypofys ordentligt från att utveckla möss. Först, möss har fastställts genom transcardial perfusion av formaldehyd före dissektion. Sedan tillämpas tre olika dissekera tekniker för att erhålla intakt hypofys beroende på ålder av möss. För fostrets möss åldern embryonala dagar (E) 17,5-18,5 och nyfödda upp till 4 dagar, är hela sella regioner inklusive sphenoid benet, körtel och trigeminal nerver dissekeras. För valpar är åldern postnatal dagar (P) 5-14, hypofys ansluten med trigeminal nerver dissekerade som helhet. För möss över 3 veckor gammal, är hypofys noggrant dissekeras fri från de omgivande vävnaderna. Vi visar också hur till bädda in hypofys i en rätt orientering med omgivande vävnader som sevärdheter för att få tillfredsställa koronalt avsnitt. Dessa metoder är användbara i att analysera histologiska och utvecklingsmässiga egenskaper hos hypofys utveckla möss.
Introduction
Den hypofysen eller hypofysen är ett viktigt endokrina organ som utsöndrar hormoner som är väsentliga för homeostas1,2. Anatomiskt, är hypofysen en ” två-i-ett ” struktur bestående av neurohypophysis och i adenohypofysen. Dessa delar har olika embryonala ursprung och funktion mycket olikt. Neurohypophysis härrör från neural ektodermet och utsöndrar oxytocin och Antidiuretiskt hormon. I adenohypofysen påbörjar från Rathkes påse och ansvarar för frisättning av hormoner inklusive tillväxthormon, prolaktin, sköldkörtel – stimulerande hormon, follikelstimulerande hormon, luteiniserande hormon, adrenokortikotropt hormon, och melanocytstimulerande hormon –3,4,5.
Hypofysen vilar på den dorsala ytan av sphenoid benet (sella turcica) mus skallbasen och är kopplad till golvet i hjärnan av en bräcklig stjälk. Det omges sidled av trigeminal nerver och anteriorly av den optiska chiasm6,7. Körteln har en långsträckt oval form med dess längdaxel vinkelrätt mot det av huvudet. På dess dorsala ytan, neurohypophysis och adenohypofysen kan enkelt avgränsas, med den förstnämnda ockuperar dorsala mediala regionen och den senare förlängning sidled och ventralt. Under födsel, storleken på hypofysen ökar snabbt i den första månaden efter födseln8,9. Mus hypofysen är dock fortfarande mycket liten i storlek med en genomsnittlig vikt på 1,9 mg och en lång-axel diameter ~ 3 mm vuxen10, en lång-axel diameter på 2-2,5 mm postnatal dag 21 (P21) och bara 1-1.5 mm på P0.
En koronalt avsnitt föredras att visa både adenohypofysen och neurohypophysis i en enda bit av mus hypofysen. Dock krävs vissa tekniska färdigheter för att få tillfredsställande koronalt avsnitt av hypofys från att utveckla möss på grund av dess exceptionellt små storlek och distinkta anatomi. I denna video artikel visar vi hur du dissekera mus hypofys och förbereda hypofysen koronalt avsnitt vid olika utvecklingsstadier.
Protocol
Representative Results
Discussion
För att utveckla murina nekrohypofyser, har det varit tekniskt svårt att få ordentlig koronalt avsnitt på grund av sina små och ömtåliga funktioner och unika anatomiska egenskaper6,8. Vissa forskargrupper valde därför mid-sagittal avsnitt att analysera morfologi av embryonala och neonatal hypofysen11,12. Dock avsnittet mid-sagittal i hypofysen är också kapabel att visar främre, mellanliggande …
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Detta arbete stöds av anslag från National Natural Science Foundation Kina (31201086, 31470759 och 31671219) och Shanghai naturvetenskap Foundation (12ZR1436900).
Materials
| Tools/Equipment | |||
| Surgical scissors-straight | JinZhong | J21010 | can be purchased from other vendors |
| Fine scissors-strainght | JinZhong | WA1010 | can be purchased from other vendors |
| Blunt forceps | JinZhong | JD1020 | can be purchased from other vendors |
| Fine forceps | Dumont | RS-5015 | for isolation of the pituitary |
| 26G (0.45mm) needle | HongDa | for transcardial perfusion | |
| Syringe (1 mL) | BD | 300841 | can be purchased from other vendors |
| Syringe (10 mL) | BD | can be purchased from other vendors | |
| 35mm dish | Corning | 430165 | can be purchased from other vendors |
| Lens cleaning paper | ShuangQuan | can be purchased from other vendors | |
| Anatomical microscope | OLYMPUS | SZX-ILLB2-200 | can be purchased from other vendors |
| Embedding cassette | Thermo Fisher | 22-272423 | can be purchased from other vendors |
| Tissue embedding console system | KEDEE | KD-BM11 | can be purchased from other vendors |
| Microtome | Thermo Fisher | HM315R | can be purchased from other vendors |
| Superfrost-Plus slides | Thermo Fisher | 22-037-246 | can be purchased from other vendors |
| Cover glass | Thermo Fisher | 12-543 | can be purchased from other vendors |
| Fluorescence microscope | OLYMPUS | BH2-RFCA | can be purchased from other vendors |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagents | |||
| Urethane | BBI | EB0448 | |
| NaCl | Sigma | S9625 | for PBS |
| KCl | Sigma | P9541 | for PBS |
| Na2HPO4.12H2O | Sigma | 71650 | for PBS |
| K2HPO4 | Sigma | P2222 | for PBS |
| NaNO2 | Sigma | 237213 | |
| Heparin Sodium Injection | SPH | H31022051 | for perfusion saline |
| Paraformaldehyde (PFA) | Sigma | P6148 | |
| Ethanol | SCR | 10009218 | |
| Xylene | SCR | 10023418 | |
| Paraffin | Thermo Fisher | 8330 | |
| Hematoxylin | Sigma | H9627 | for H&E staining |
| Eosin Y | Sigma | E4009 | for H&E staining |
| rabbit anti growth hormone (GH) | National Hormone | for immunostaining | |
| antibody | Pituitary Program | ||
| Rabbit anti-mouse GFAP antibody | Sigma | G9269 | for immunostaining |
| Goat anti-rabbit IgG, HRP | Jackson | 111-035-003 | for immunostaining |
| TSA system | NEN Life Science Products | NEL700 | for immunostaining |
| Streptavidin, Alexa Fluor 594 | Thermo Fisher | S32356 | for immunostaining |
| Anti-FITC Alexa Fluor 488 | Thermo Fisher | A11090 | for immunostaining |
Referências
- Fauquier, T., Lacampagne, A., Travo, P., Bauer, K., Mollard, P. Hidden face of the anterior pituitary. Trends Endocrinol Metab. 13 (7), 304-309 (2002).
- Haedo, M. R., et al. Regulation of pituitary function by cytokines. Horm Res. 72 (5), 266-274 (2009).
- Zhu, X., Gleiberman, A. S., Rosenfeld, M. G. Molecular physiology of pituitary development: signaling and transcriptional networks. Physiol Rev. 87 (3), 933-963 (2007).
- Bancalari, R. E., Gregory, L. C., McCabe, M. J., Dattani, M. T. Pituitary gland development: an update. Endocr Dev. 23, 1-15 (2012).
- Kelberman, D., Rizzoti, K., Lovell-Badge, R., Robinson, I. C., Dattani, M. T. Genetic regulation of pituitary gland development in human and mouse. Endocr Rev. 30 (7), 790-829 (2009).
- Peker, S., Kurtkaya-Yapicier, O., Kilic, T., Pamir, M. N. Microsurgical anatomy of the lateral walls of the pituitary fossa. Acta Neurochir (Wien). 147 (6), 641-648 (2005).
- Wolpert, S. M., Molitch, M. E., Goldman, J. A., Wood, J. B. Size, shape, and appearance of the normal female pituitary gland. AJR Am J Roentgenol. 143 (2), 377-381 (1984).
- Carbajo-Perez, E., Watanabe, Y. G. Cellular proliferation in the anterior pituitary of the rat during the postnatal period. Cell Tissue Res. 261 (2), 333-338 (1990).
- Nantie, L. B., Himes, A. D., Getz, D. R., Raetzman, L. T. Notch signaling in postnatal pituitary expansion: proliferation, progenitors, and cell specification. Mol Endocrinol. 28 (5), 731-744 (2014).
- Tzou, S. C., Landek-Salgado, M. A., Kimura, H., Caturegli, P. Preparation of mouse pituitary immunogen for the induction of experimental autoimmune hypophysitis. J Vis Exp. (46), (2010).
- Budry, L., et al. Related pituitary cell lineages develop into interdigitated 3D cell networks. Proc Natl Acad Sci U S A. 108 (30), 12515-12520 (2011).
- Wilson, D. B., Wyatt, D. P. Histopathology of the pituitary gland in neonatal little (lit) mutant mice. Histol Histopathol. 7 (3), 451-455 (1992).
- Jonkers, B. W., Sterk, J. C., Wouterlood, F. G. Transcardial perfusion fixation of the CNS by means of a compressed-air-driven device. J Neurosci Methods. 12 (2), 141-149 (1984).
- Cao, D., et al. ZBTB20 is required for anterior pituitary development and lactotrope specification. Nat Commun. 7, 11121 (2016).
